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人活化血小板单抗SZ-51单链抗体的基因构建及高效表达
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第4期第20卷 基因工程抗体
作者：夏晓波 万海英 王斌 顾建明 阮长耿
单位：215007，苏州医学院附属第一医院，江苏省血液研究所血栓与止血研究室）
关键词：单克隆抗体；单链抗体；活化血小板
【 摘要 】 目的 为降低鼠源性抗体对人体的免疫原性并降低其分子量，进行了人活化血小板单克隆抗体SZ-51单链抗体(ScFv)的基因构建及表达，希望摸索出一套稳定、高效表达SZ-51 ScFv的方法。 方法 同时构建了两种不同的SZ-51 ScFv表达载体pHEN1-51 ScFv及pET20b-51 ScFv，并分别导入大肠杆菌HB2151及BL21(DE3)plys 中进行表达，同时对它们的表达特性进行了比较。 结果 pHEN1-51 ScFv在HB2151中经IPTG诱导后，SZ-51 ScFv以可溶性形式分泌至细菌培养上清中。pET20b-51 ScFv在BL21(DE3)plys中经IPTG诱导后，SZ-51 ScFv以可溶性与不溶性的包涵体两种形式存在，其表达量占菌体总蛋白的20%。经Western blot证明两种体系表达产物均维持了亲本抗体与活化血小板特异性结合的能力。 结论 pET20b表达体系对于SZ-51 ScFv而言是一种稳定、高效的表达体系。但其包涵体部分的变复性条件仍需进一步探讨。
The expression of single chain Fv fragment of monoclonal antibody against activated platelets in E.coli
XIA Xiaobo, WAN Haiying, WANG Bin
（Jiangsu Institute of Hematology, Thrombosis and Haemostasis Research Unit, First Affiliated Hospital, Suzhou Medical College, Suzhou 215007, P.R.China）
【 Abstract 】 Objective To reduce immunogenicity and molecular weight of a monoclonal antibody specific for activated human platelet and to express single chain Fv fragment (ScFv) in E.coli. Methods Two expression vectors of SZ-51 ScFv, pHEN1-51 ScFv and pET20b-51 ScFv, were constructed and transformed into E.coli strain HB2151 and BL21(DE3) plys, respectively. The expressed recombinant proteins were analysed. Results Induced by IPTG, HB2151 secreted soluble SZ-51 ScFv to the cultured supernatant. The BL21 (DE3) plys expressed the SZ-51 ScFv the soluble recombinant protein and insoluble recombinant protein in inclusion bodies and constituted 20% of the total cell protein. Western blot analysis showed that the SZ-51 ScFv obtained from two strains of E.coli maintained the binding activity to activated human platelet as their parent ones. Conclusion The results showed that the pET20b expression system is stable and efficient for expressing SZ-51 ScFv. However, the denaturation and protein refolding of the SZ-51 ScFv expressed in inclusion bodies need to be studied further.
【 Subject words 】 Monoclonal antibody; Single-chain Fv; Activated human platelet
SZ-51是我室于1989年通过杂交瘤技术制备的一株抗人活化血小板GMP-140单克隆抗体，已通过动物体内外实验证实具有良好的血栓导向能力，可作为导向溶栓和导向血栓显像的优良导向载体〔1〕。为降低其鼠源性抗体对人体的免疫原性并降低其分子量，以适应临床使用的需要，有必要通过基因工程的手段对其进行“人源化”改造或表达抗体各类功能片段。为此目的，我室于1995年用RT-PCR技术从SZ-51杂交瘤细胞中扩增出其重、轻链可变区基因片段，分别克隆至pUC18中并进行了测序〔2〕。本文在此基础上进行了SZ-51单链抗体不同表达载体的构建工作，并对在不同大肠杆菌表达体系中表达SZ-51单链抗体进行了比较，摸索出了一套稳定、高效表达SZ-51 ScFv的方法。
材料与方法
1.实验材料
引物：
P1：5′-CAACTGCAGGAGTCTGGACCTGAG-3′
PstⅠ
P2：5′-GACGGTGACCGAGGTTCCCTGACC-3′
BstEⅡ
P3：5′-CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCA-3′
SacⅠ
P4：5′-GATCTCGAGCTTGGTTCCTCC-3′
XhoⅠ
P5：5′-TTCTGCGGCCGCCCGTTTGATCTCGAGCTT-3′
NotⅠ
P6：5′-AAGGATCCACTGCAGGAGTCTGGA-3′
BamHⅠ PstⅠ
P7：5′-CGCCAAGCTTATTCAGATCCTCTTCTGAG-3′
HindⅢ
以上引物均由中国科学院上海细胞研究所基因室合成。
质粒及菌株：质粒pUC18-51VH及pUC18-51Vκ为本室构建保存。质粒pSW1-ScFv、pHEN1及菌株HB2151由英国剑桥MRC实验室Winter博士惠赠。菌株TG1为本室保存。质粒pET20b及菌株BL21(DE3)plys购自Novagen公司。
试剂：限制性内切酶为Boehringer Mannheim产品；T4 DNA连接酶为BioLabs产品；PCR扩增试剂盒为PE Cetus产品；α-［32P］-dATP购自北京福瑞公司；随机引物标记试剂盒为Amersham产品；IPTG为 Promega产品；His-bind-Resin亲和层析柱购自Novagen公司；125I为北京401所产品；丙烯酰胺与双丙烯酰胺为Sigma产品；羊抗鼠IgG购自上海华美生物工程公司；鼠源抗Myc单抗购自天津血液学研究所。
2.方法
PCR产物的克隆测序：PCR参照Saiki等〔3〕描述的方法进行。PCR扩增产物以等体积氯仿/异戊醇(24/1)抽提一次，2.5倍体积乙醇沉淀后，经琼脂糖低熔点凝胶电泳分离纯化扩增基因片段，经Klenow DNA多聚酶补平或经限制性内切酶消化后，克隆到经相应处理的pUC18空载体中。空载体与插入片段以1∶10摩尔数比混合，在T4 DNA连接酶催化下于16℃反应过夜，转化TG1感受态细菌后抽提质粒DNA，经酶切鉴定阳性质粒。通过Sanger双脱氧末端终止法进行DNA序列测定。
表达载体的构建
(1) pSW1-51 ScFv的构建：通过P1与P2，P3与P4两对引物分别从pUC18-51VH及pUC18-51Vκ中扩增出SZ-51单抗VH与Vκ基因并引入相应酶切位点。SZ-51 VH用PstⅠ和BstEⅡ双酶切；SZ-51Vκ用SacⅠ和XhoⅠ双酶切，相继与同样酶切处理的包含ScFv基因的pSW1-ScFv空载体连接，转化TG1感受态细菌后抽提质粒DNA，经酶切鉴定筛选获得阳性克隆pSW1-51 ScFv。应用随机引物法将α-［32P］-dCTP标记于SZ-51重链和轻链可变区基因片段上，并以此为探针经Slot-blot杂交验证阳性克隆。
(2) 表达载体pHEN1-51 ScFv的构建：以pSW1-51 ScFv为模板，以P1与P5为引物扩增SZ-51 ScFv片段并引入相应酶切位点。与表达质粒pHEN1经PstⅠ和NotⅠ双酶切后，进行连接并转化感受态细菌HB2151，经酶切鉴定筛选获得阳性克隆pHEN1-51 ScFv，再经Slot-blot方法验证阳性重组子。pHEN1载体中具有一段Myc蛋白基因，将为表达产物的检测提供方便。
(3) 表达载体pET20b-51 ScFv的构建：以pSW1-51 ScFv为模板，以P6与P7为引物扩增SZ-51 ScFv片段并引入相应酶切位点。将纯化的SZ-51 ScFv单链基因片段用BamHⅠ、HindⅢ双酶切后克隆至经相同酶切处理的pET20b空载体中，转化感受态细菌TG1后抽提质粒DNA，并经酶切鉴定筛选获得阳性克隆pET20b-51 ScFv。再经Slot-blot方法验证阳性重组子。用阳性质粒转化感受态细菌BL21(DE3)plys，经同样酶切鉴定及Slot blot筛选获得阳性克隆，并按Novagen公司说明书进行质粒稳定性试验。pET20b载体中含有一段6xHis-tag，为表达产物的纯化提供了方便。
可溶性51 ScFv片段在大肠杆菌HB2151中的表达〔4〕：将质粒pHEN1-51 ScFv重组体转化的HB2151单个菌落接种至2×TY培养液(内含100μg/ml氨苄青霉素，1%葡萄糖)中，37℃振摇，待A550=0.5～1.0时，收集细菌，以50mmol/L NaCl洗涤1次，细菌沉淀悬浮于2ml 2×TY(内含100μg/ml氨苄青霉素，0.8mmol/L IPTG)中，37℃振摇16～24h。取上清进行SDS-PAGE及Western blot直接测定表达抗体蛋白及抗体活性。
51 ScFv片段在大肠杆菌BL21(DE3)plys中的表达： 将表达载体pET20b-51 ScFv重组体转化的BL21(DE3)plys单个菌落接种至2×TY培养液(含100μg/ml氨苄青霉素，34μg/ml氯霉素及1%葡萄糖)中，37℃振摇，待A600=0.6时，收集细菌，将细菌重悬于2ml培养基中，按1∶20接种至50ml含相同浓度抗生素的LB中，37℃振摇，待A600=0.6时，加IPTG（0.7mmol/L）诱导，30℃振摇2.5h，在4℃下5000r/min离心10min收获细菌。以20mmol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl洗涤液洗1次，加1/10（v/v）溶菌液（20mmol Tris-HCl，含1% Triton X-100，250μmol/L PMSF以及100μg/ml溶菌酶），30℃放置15min，然后在冰上超声处理（输出功率80%）10s，停10s，反复3～5次，至细胞悬液不再粘稠。在4℃ 2000×g离心20min，分别收集细胞上清及沉淀。沉淀再结合缓冲液（20mmol/L Tris-HCl pH8.0，0.5mol/L NaCl，5mmol/L咪唑）洗涤1次，而后，重悬于上述结合缓冲液（另含6mol/L尿素）中，冰中搅拌溶解1h，4℃，12000×g离心20min，收集上清，经0.45mm滤膜过滤，然后上His-Bind Resin亲和层析柱纯化，纯化产物分别在400ml含有下列成分的50mmol/L Tris-HCl pH8.5缓冲液透析：（1）4mol/L尿素；（2）2mol/L尿素，1mmol/L氧化型谷胱甘肽；（3）2mol/L尿素，0.5mol/L还原型谷胱甘肽；最后在50mmol/L Tris-HCl, 0.15mol/L NaCl透析。收集上述各阶段产物，进行12% SDS-PAGE电泳，以确定表达产物在菌体中的位置及含量，同时以标准分子量判断其大小。通过Western blot及放免法测定表达产物抗体活性。
表达产物各项性质测定
(1) 表达产物的SDS-PAGE电泳：将经IPTG诱导表达的培养物离心后收集上清或细菌，以空白质粒的转染菌株做阴性对照，将经处理的诱导表达产物和阴性对照一起进行12% SDS-PAGE〔5〕， 电泳后，一半胶做考马斯亮蓝染色，染色后经Hoefre公司GS300型扫描仪扫描后，以标准蛋白做参照估算特异性产物表达量及其在菌体总蛋白中的比例。另一半胶做Western blot。
(2) Western blot〔6〕：pHEN1-51 ScFv 表达上清及其对照，pET20b-51 ScFv表达产物超声上清、超声沉淀及其对照经12% SDS-PAGE电泳后，转移至硝酸纤维膜上加入抗Myc单抗，37℃温育2h，然后加入125 I标记的羊抗鼠IgG，或直接加入125I标记的抗Myc单抗，37℃温育2h，最后进行放射自显影。
将凝血酶活化的血小板(2×108/ml)以等体积的2×SDS上样缓冲液(10mmol/L Tris-HCl pH6.7，4% SDS，0.2%溴酚蓝，20%甘油)处理后，200μl/孔上样，进行7% SDS-PAGE 电泳。电泳结束后，转移至硝酸纤维膜上，与pHEN1-51 ScFv表达上清在37℃进行温浴2h，再加入抗Myc单抗，37℃温浴2h，最后加入125I标记的羊抗鼠IgG，进行放射自显影。羊抗鼠IgG的125I标记采用Iodogen 法〔7〕。
(3) 放免法（IRMA）检测SZ-51 ScFv抗体活性：取3.8%枸橼酸1∶10抗凝新鲜全血分离出血小板，以TEN（20mmol/L Tris-HCl pH7.4，0.6mmol/L EDTA，0.15mol/L NaCl）洗涤2次，0.01mol/L PBS重悬，以1U/ml凝血酶37℃诱导5min，以2×105血小板/孔包被于酶标板中，37℃过夜。次日以0.25%戊二醛固定15min，0.05%吐温-PBS洗涤液洗2次，10%小牛血清封闭（100μl/孔），37℃ 2h，再以洗涤液洗2次后加入等量的pET20b-51 ScFv表达产物超声上清及超声沉淀变复性后纯化产物，37℃温育2h，经洗涤后再加入125I标记的抗Myc单抗（3×105cpm/200μl）37℃孵育2h，经充分洗涤后，用γ计数器测各样品孔的放射性计数（cpm）。以0.01mol/L PBS做为空白对照。
结果
1.表达载体的构建：通过PCR分别扩增出SZ-51VH及SZ-51Vκ，经适当酶切后相继克隆至pSW1-ScFv载体，构建得到了pSW1-51 ScFv。通过两对引物分别扩增出含不同酶切位点的SZ-51 ScFv基因片段，经适当酶切后分别克隆至pHEN1载体及pET20b载体中，获得了目的表达载体pHEN1-51 ScFv及pET20b-51 ScFv（图1）。各步PCR产物均经测序证明序列正确。各步均通过酶切筛选鉴定重组载体。阳性克隆又均通过Slot blot鉴定。
图1 SZ51-ScFv表达载体构建图
Fig 1. Construction of SZ51-ScFv expression vector
P:PstⅠ; Bs:BstEⅡ; S:SacⅠ; X:XhoⅠ; N:NotⅠ; B:BamHⅠ; H:HindⅢ
2.可溶性SZ-51 ScFv在大肠杆菌HB2151中的表达： pHEN1-51 ScFv在非抑制性大肠杆菌HB2151中经IPTG诱导表达后，通过SDS-PAGE电泳及Western blot证实，该单链抗体以可溶性形式分泌入细菌培养上清中，其相对分子质量约为34×103。经Western blot证实表达的SZ-51 ScFv具有与亲本鼠源单抗SZ-51相同的与活化血小板上14×104的蛋白带相结合的能力（图2）。
3.SZ-51 ScFv在大肠杆菌BL21(DE3)plys中的表达： pET20b-51 ScFv转入BL21(DE3)plys中，经质粒稳定性试验证实质粒稳定。经IPTG诱导表达后，通过SDS-PAGE电泳证实，该单链抗体以可溶性部分与不溶性的包涵体两种形式存在，其中以包涵体形式存在为主。其相对分子质量约为31×103。经考马斯亮蓝染色，Hoefre公司GS300型扫描仪扫描后估算其特异性表达产量约占菌体总蛋白量的20%，（图3）。经放免法（IRMA）证实表达的SZ-51 ScFv具有与亲本鼠源单抗SZ-51相同的与活化血小板相结合的能力。
图2 SZ51-ScFv在pHEN1的分泌表达及SPS-PAGE和Western blot检测
Fig 2. SDS-PAGE and Western blot of SZ51-ScFv expressed in pHEN1 system
A. SDS-PAGE and Western blot of expressed supernatant of pHEN1-51 ScFv
1. LMW marker of protein；2. Expressed supernatant of pHEN1-51 ScFv； 3. 2+anti-Myc McAb+125I-GAM； 4. Expressed supernatant of pHEN1+anti-Myc McAb+125I-GAM
B. Western blot of the antigen-binding activity of expressed supernatant of pHEN1-51 ScFv
1. HMW marker of protein；2. Activated platelets+SZ-51+125I-GAM； 3. Activated platelets+ expressed supernatant of pHEN1-51 ScFv+anti-Myc McAb+125I-GAM； 4. Activated platelets+expressed supernatant of pHEN1+125I-GAM
讨论
利用单克隆抗体作为导向载体进行血栓的导向显像及导向溶栓是近年来兴起的血栓性疾病诊断及治疗的有效手段之一。但由于鼠源性单抗具有较强的免疫原性，进入人体后易产生人抗鼠抗体（HAMA）反应，且由于其相对分子质量大，不易清除，用于导向显像时可产生较高背景等缺点，使其不适合临床广泛应用。因此，人们越来越多地应用基因抗体工程技术制备人源化单抗、嵌合抗体及抗体小功能片段，如Fab及ScFv等。其中，ScFv由于其分子量小、免疫原性低、更易代谢等优点而倍受青睐。
由于ScFv表达产量低，因此我们此次构建了两种不同的SZ-51 ScFv表达载体，并引入不同的大肠杆菌中进行了表达，希望可以找到一种能高效表达SZ-51 ScFv的方法。结果显示两种表达体系均成功地获得了SZ-51 ScFv表达产物，且表达产物均保持了SZ-51与人活化血小板GMP-140特异性结合的能力。其中，pHEN1-51 ScFv在非抑制性大肠杆菌HB2151中表达时，该宿主菌可识别载体中的琥珀突变，使ScFv得到表达并进入细胞外周质中进行折叠，最后以可溶性形式分泌入细胞培养上清中。该表达产物不需复杂的变复性过程，但特异性表达量较低。
图3 SZ51-ScFv在pET20b的表达及SDS-PAGE和Western blot检测
Fig 3. SDS-PAGE and Western-blot of SZ51-ScFv expressed in pET20b system
1. LMW marker of protein; 2. IPTG-induced strain protein; 3. Non IPTG-induced strain protein; 4. Supersonic precipitation(inclusion bodies)+anti-Myc McAb-125I; 5. Supersonic supernatant(soluble part)+anti-Myc McAb-125I; 6. Non IPTG-induced strain protein+anti-Myc McAb-125I; 7. IPTG-induced strain protein+anti-Myc McAb-125I
pET系统是目前最强有效的大肠杆菌表达系统之一。我们构建的pET20b-51 ScFv转入大肠杆菌BL21(DE3)plys中进行表达时，表达产物以可溶性部分与不溶性的包涵体两种形式存在。特异性表达量约占菌体总蛋白量的20%，达到了高效表达，且表达所需诱导时间较短。但由于表达产物以包涵体形式存在为主，经过变复性后抗体活性损失较大，通过放免法测定显示，变复性后表达产物活性远低于其可溶性部分，因此需要进一步摸索最佳变复性条件，或进一步摸索最佳诱导温度以提高其可溶性表达产物的比率。但总的说来，pET20b表达系统对于SZ-51ScFv而言，仍不失为一种稳定、高效的表达系统。
基金项目：核工业科学基金资助项目(Y3426292101)；江苏省科委基金资助项目(BJ96015)
参考文献
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(收稿日期：1999-03-12)