抗KG1a细胞噬菌体展示ScFv的筛选及鉴定

【 摘要 】　目的　应用KG1a细胞（髓系白血病细胞系）筛选噬菌体抗体库，获得能以一定特异性结合KG1a细胞的单链抗体(ScFv)，克隆其基因并研究其对应抗原在不同细胞表面的分布。方法　用完整的KG1a细胞筛选一个经KG1a细胞免疫小鼠脾细胞的ScFv噬菌体抗体库，重复筛选4轮; 细胞ELISA鉴定了其中96个克隆与KG1a细胞的结合反应; 从26个KG1a细胞ELISA阳性克隆中挑选了3个克隆，进一步用免疫荧光染色、流式细胞仪分析其各自对应抗原在不同细胞表面的分布，并对其中2个克隆的ScFv编码基因进行序列测定。结果　流式细胞仪分析结果显示, 3个克隆所识别的抗原均存在于不同白血病细胞表面，但比例分布不同，而 3个克隆之间又略有差异，其中2个克隆的DNA序列测定结果显示其核苷酸序列和氨基酸顺序有所不同，均属小鼠免疫球蛋白同一可变区基因家族和亚群，重链可变区（V_H）属亚群Ⅱ、家族Ⅵ，轻链可变区（Vκ）属亚群Ⅲ、家族Ⅸ。结论　用完整细胞筛选噬菌体抗体库可有效分离细胞表面分子的抗体片段及其基因，这种方法对于筛选和获得此类难以分离纯化和未知的细胞表面分子的抗体具有良好的应用价值；用KG1a细胞筛选所得的抗体及其基因对于进一步研究和发现白血病细胞表面分子具有重要意义。

Screening and identification of anti-KG1a cell ScFvs from a phage display antibody library

SUI Jianhua, HE Yixin, XU Jing, et al.

　　(Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Tianjin 300020, P. R. China)

　　【 Abstract 】　Objective　Screening and cloning of anti-KG1a cell single chain antibodies (ScFvs) from phage display antibody library.Methods　A ScFv phage display library from the spleen cells of mice immunized with KG1a cells (acute myelogenous leukemia cell line) was selected by using the immunizing cells. After 4 rounds of panning, 96 individual clones of phage-ScFvs were tested by cell ELISA. Three out of the 26 positive clones them were further checked for the distribution of their antigens on different cells by using immunofluorescence flow cytometry.Results　Flow cytometry assay showed different distribution of the antigens on different leukemia cells. DNA sequences and deduced amino acid sequences of the two clones analyzed both belong to the same mouse Ig V region subgroup and family: The V_H belongs to subgroup Ⅱand family Ⅵ, the Vκ belongs to subgroup Ⅲ and family Ⅸ.Conclusion　Intact cells can be used effectively to screen, isolate and clone ScFv genes against cell surface molecules which are usually hard to isolate and purify. The anti-KG1a ScFvs we obtained are promising for further studying and isolating the cell surface molecules of leukemia cells.

　　【 Subject words 】　Phage display antibody library; ScFv; KG1a cell; Surface molecule

　　噬菌体展示抗体库技术近年来发展很快，日益成为制备单抗的有效手段。目前不仅已广泛应用于筛选针对纯化抗原的抗体片段，而且更为重要的进展之一是应用于复合抗原的筛选。这对于那些难以分离、纯化并获取一定量的抗原分子如膜结合型或细胞表面抗原分子等的抗体的分离和制备，以及发现未知的细胞表面分子具有重要的意义^〔1〕。我们探索了应用髓系白血病细胞KG1a筛选一个自建的噬菌体抗体库，以期分离白血病相关细胞表面分子抗体及发现新的细胞表面分子。

　　材料与方法

　　实验材料：载体、菌株、辅助噬菌体及细菌培养基等同参考文献〔2〕。细胞系：昆虫细胞Sf9；鼠成纤维细胞NIH-3T3；人胚肾细胞293；人肝癌细胞7402；人宫颈癌细胞HeLa；人骨髓基质细胞HFLC；人髓系白血病细胞KG1a、HL60、U937；人红白血病细胞K562、HEL；人B淋巴细胞白血病细胞系Namalwa、LCL；人T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat。正常人外周血来自健康献血者（共2例）。

　　噬菌体单链抗体库: 来自KG1a细胞免疫小鼠的脾脏B淋巴细胞，为本组构建并鉴定了其库容、多样性及文库对外源抗体的表达能力^〔2〕。

　　抗体库的筛选

　　抗体文库噬菌体抗体上清的制备：取一部分保存的文库菌种悬于6ml 2×YTGA培养基中使A600为0.8左右，加入辅助噬菌体M13KO7（感染复数MOI=10），37℃静置温育60 min，离心沉淀感染的细胞，并重悬于8ml 2×YTAKT中，37℃培养5～8 h，离心收集上清即为展示有ScFv噬菌体文库。

　　用完整KG1a细胞筛选噬菌体展示ScFv文库：取3×10⁶ KG1a细胞，PBS洗涤，加入1ml含2%脱脂奶的PBS静置30 min（室温22℃～25℃，以下操作均在室温下进行），加入300μl ScFv文库噬菌体上清(滴度约3×10¹¹)和4倍量的M13KO7（1.2×10¹²），轻摇90 min，PBST(含0.05% Tween 20的PBS)洗15次后离心沉淀细胞后加入500μl洗脱液(0.1mol/L甘氨酸/HCl, pH=2.5，含0.1%BSA)，冰浴5 min后10 000×g离心2 min，立即加入20μl 1mol/L的Tris中和，而后加入400μl A600=0.8的XL1-Blue，静置10 min感染XL1-Blue，全部铺于SOBGA培养板，37℃培养过夜，计算菌落形成单位（CFU），即为筛选后所得噬菌体颗粒数，刮取菌落获得KG1a细胞筛选后的噬菌体次级抗体库再进行下1轮的筛选，同样方法筛选4轮，其中只是每一轮筛选时所用的噬菌体数量不同（表1）。

　　单个克隆的噬菌体抗体制备：随机挑取96个筛选4轮后的单个克隆，按前述方法获得在噬菌体表面展示有ScFv的单个克隆的噬菌体抗体上清，直接用于细胞ELISA检测；PEG/NaCl溶液沉淀、浓缩噬菌体抗体上清^〔2〕，用于免疫荧光分析。

　　检测噬菌体抗体与细胞的结合

　　细胞ELISA（室温下操作）：以100μg/μl多聚左旋赖氨酸（Sigma）100μl/孔包被96孔酶标板（Nunc公司），37℃烘干，加入100μl PBS重悬的2×10⁵细胞/孔，静置6～8 h，弃上清，0.24%戊二醛100μl/孔固定细胞30 min，PBS洗涤1次，加入单个克隆的噬菌体抗体上清（2～3)×10⁹ 100μl/孔，孵育2 h，PBST洗涤8次后用HRP-抗M13抗体（Phamacia公司）检测结合的噬菌体颗粒，四氨基联苯胺（TMB）为底物，显色8 min，测定450nm的光吸收值（A450）。阴性对照为与构建文库同一载体表达的抗PHOX的噬菌体抗体（由德国癌症研究中心Duble博士惠赠）。

　　免疫荧光：取10⁶细胞与（2 ～3)×10¹¹噬菌体抗体在含2%脱脂奶的PBS中混匀，室温1 h（以后操作均在4℃进行），加入抗-M13抗体（Pharmacia公司）孵育1 h，洗涤后，用FITC-大鼠抗小鼠荧光抗体（本所制备）标记细胞，经流式细胞仪（Coulter公司）分析10 000个细胞，计算阳性率。阴性对照同上述细胞行ELISA。

　　DNA序列测定：以双链质粒DNA为模板，以构建文库所用V_H的5′端引物和Vκ的3′端引物分别作为测序引物^〔2〕，ABI373A型测序仪进行双向、双链测序。

　　结果

　　1. 噬菌体抗体库的筛选：用KG1a对噬菌体ScFv抗体库进行了4轮的富集筛选，每轮对从KG1a细胞表面洗脱下来的噬菌体颗粒进行了滴度测定，显示洗脱下来的噬菌体量逐渐升高，提示有特异性的富集（表1）。

表1　筛选对特异性噬菌体抗体的富集

　　Table 1.Enrichment of specific phage antibody by panning

Rounds of panning	Input phage (CFU)	Eluted phage (CFU)
1	3.0×1011	2.00×103
2	2.4×1011	4.00×104
3	1.0×1011	1.50×104
4	1.0×1011	3.18×105

　　2．单克隆与细胞结合反应

　　(1)细胞ELISA结果：用Sf9、NIH-3T3、293、HeLa、7402、HFCL等其他种属及人非血液系统细胞和KG1a细胞分别与96个克隆的噬菌体抗体进行细胞ELISA检测，结果表明其中26个克隆呈现与KG1a细胞强的特异性结合(表2示部分克隆的结果)。

表2　克隆5C1、28、1B3的细胞ELISA结果

　　Table 2. Cell ELISA assays of 5C1,28 and 1B3 phage clones for binding to KG1a cells

Absorbance at 450nm (A450)
	KG1a	Non-human cell lines		Human non-hematopoietic cell lines
		Sf9	NIH-3T3	293	7402	HeLa	HFLC
5C1	0.616	0.091	0.138	0.121	0.058	0.102	0.161
28	0.726	0.125	0.212	0.010	0.004	0.088	0.123
1B3	0.724	0.092	0.250	0.040	0.102	0.128	0.080

　　Note：For each clone the same quantity of phage particles (2-3)×10⁹ was used in all assays. All assays and each well were done in duplicate. The ELISA readings were the average of the two wells　　（2）免疫荧光分析：随机选取其中3个克隆（5C1、28、1B3），进行免疫荧光染色，分析与不同的人白血病细胞系KG1a、HL60、U937、K562、HEL、Namalwa、

　　图1　流式细胞术测定单克隆（5C1、28、1B3）的识别分子在髓系白血病细胞表面的分布

　　Fig 1. Flow cytometric analysis of expression of the molecules recognized by the ScFv in clone 5C1,28 and 1B3

　　图2　克隆5C1、1B3的V<