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抗CD3嵌合抗体片段Fab′突变体的表达和生物活性研究
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第4期第20卷 基因工程抗体
作者：徐晨 许元富 熊冬生 彭晖 邵晓枫 朱祯平 杨纯正
单位：300020 天津，中国医学科学院 中国协和医科大学 血液学研究所实验血液学国家重点实验室
本实验室已构建的抗CD3单抗片段表达量较低，不利于今后的研究和应用。为此我们参照PDB文库和有关文献，对抗CD3单链抗体(ScFv)重链基因第6位(Glu-Gln)和第105位(Cys-Ser)氨基酸进行定点突变， 同时轻链第5位发生随机掺入的同义突变(Thr-Thr),使产量有了显著提高。
以该ScFv表达载体为模板，PCR扩增抗CD3单抗重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因，插入分别带有人重链CH1区和人轻链恒定区(CL)κ链的中间载体。再将酶切获得的VH+CH1和VL+CL片段插入PA载体相应位点得到抗CD3嵌合抗体Fab′表达载体。
连接产物转化大肠杆菌16C9进行可溶性表达，将周间质提取液经Protein G亲合层析纯化。纯化产物经SDS-PAGE电泳显示相对分子质量(Mr)为43000附近单一条带，与预期分子量相符。Folin酚法检测蛋白浓度发现Fab′片段产量比突变前提高了10倍，每升发酵液可达到3～4mg。Western-blotting结果证实产物可与人急性白血病细胞系Jurkat细胞裂解液中Mr为20000的蛋白结合，这一结果和亲代鼠源杂交瘤抗CD3抗体HIT3a的反应结果一致，表明构建的抗CD3 Fab′片段保留了亲代抗体与靶抗原的特异性反应。免疫荧光竞争结合试验进一步证明，抗CD3 Fab′片段能够通过部分封闭HIT3a与CD3+的Jurkat细胞的结合位点竞争性地抑制HIT3a对该细胞的结合。3H-TdR掺入增殖实验显示抗CD3 Fab′片段在体外能刺激正常人外周血单个核细胞增殖。51 Cr释放杀伤实验证实Fab′和IL-2共刺激产生的CD3AK细胞的细胞毒性比单用IL-2刺激产生的LAK细胞强。另外，试验证明突变后的抗CD3 Fab′片段的结合活性、促增殖活性和细胞毒性与突变前在同等剂量下没有显著改变。本研究可能为CD3单抗参与构建双功能抗体用于抗肿瘤治疗提供可参考的资料。
基金项目：国家“863”高科技基金资助项目(863-102-09-03-03)
(收稿日期：2000-04-07)