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庚型肝炎病毒NS5区部分基因的表达及其在EIA中的初步应用
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第5期第20卷 病毒学
作者：刘香萍 孔健 李秀玲
单位：100024，北京生物制品研究所
关键词：庚型肝炎病毒；NS5基因；基因表达；酶联免疫检测
【 摘要 】 目的 在大肠杆菌中表达HGV NS5抗原，以建立HGV抗体血清学检测方法。 方法 利用反转录PCR（RT-PCR）法从人血浆中分离庚型肝炎病毒NS5部分基因，克隆到pRSET A载体，经酶切初步鉴定后进行DNA序列分析，结果表明克隆序列正确。以pPROEX-1为表达载体，转化DH5α，诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blot分析。 结果 克隆的基因片段在大肠杆菌中表达出相对分子质量(Mr)约20×103的可溶性蛋白，其氨基端含有6个组胺酸肽段，可经Ni-NTA亲和层析纯化。免疫印迹分析表明，该表达产物可与HGV感染患者体内的HGV抗体特异性结合。 结论 克隆了HGV NS5部分基因并获得初步表达，表达的HGV NS5蛋白具有特异抗体结合活性，为建立检测HGV NS5抗体的血清学方法奠定了基础。
Expression of partial HGV NS5 gene and its application in EIA
LIU Xiangping，KONG Jian，LI Xiuling.
（National Vaccine and Serum Institute，Beijing 100024,P.R.China）
【 Abstract 】 Objective To clone and express HGV NS5 gene, an EIA method was established to detect anti-HGV NS5 antibody. Methods Partial NS5 gene of HGV was obtained from a healthy plasma donor by RT-PCR, then inserted into pRSET A vector, and identified by restriction enzyme digestion and DNA sequencing. The gene was cloned into expression vector pPROEX-1. E.coli DH5α was transformed by the recombinant pPROEX-1 and induced by IPTG. Results A molecular weight of 20×103 soluble protein was expressed, which had a polyhistidine (6×His) “tag” at the N-terminal, resulted in simple purification by Ni-NTA(Ni2+-nitrilo-tri-acetic acid) affinity chromatography. Western blot and ELISA demonstrated that the purified protein had specific HGV antibody-binding activity. Conclusion The result indicated that the expressed protein can be used to establish an EIA method for detection of anti-HGV NS5.
【 Subject words 】 HGV; NS5 gene; Gene expression; EIA
HGV/GBV-C（Hepatitis G Virus/GB Virus C, 以下简称HGV）是1995年新发现的一种黄病毒，从肝炎病人血清中分离得到，最初被认为是一种人类致肝炎病毒，暂命名为庚型肝炎病毒〔1，2〕。该病毒在全世界范围内均有分布，以非肠道途径感染为主，如输血，静脉注射，性接触，母婴传播等。在多次接受输血或血液制品的恶性血液病患者中，HGV感染率可达47%。美国健康献血员HGV RNA的阳性率为1.7%，显著高于HCV〔3〕。我国一般人群的HGV RNA阳性率为0.5%～2.1%，抗体阳性率为0.5%～5.1%。
已有的研究表明，HGV的NS5区相对保守，并推测具有相对强的抗原性〔4〕。本文的研究工作即利用大肠杆菌表达NS5蛋白，表达产物氨基末端含有6个组氨酸肽段，很容易经Ni-NTA鳌合层析纯化，为建立检测HGV NS5抗体的血清学方法奠定了基础，有助于获取相关流行病学资料。研究血清中抗体的变化，对阐明HGV与肝炎的关系及病毒自身的生物学特征等都有十分重要的意义。
材料与方法
质粒和菌株：质粒pRSET A购自Invitrogen公司，质粒pPROEX-1购自Gibco/BRL公司，大肠杆菌HMS174、DH5α由本室保存。
工具酶和主要试剂：限制性内切酶BamHⅠ、NdeⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA连接酶、Pwo DNA聚合酶、IPTG和dNTPs购自BM公司，AMV逆转录酶、RNA酶抑制剂（RNasin）购自Promega公司，Ni-NTA亲和层析纯化试剂购自Gibco公司，辣根过氧化物酶标羊抗人IgG为北京生物制品研究所产品。
血浆样品：河北某地单采血浆健康献血员血浆240份，中国药品生物制品检定所抗HCV抗体阳性参考血浆100份（批号9409）。
引物设计与合成：根据已发表的HGV全基因序列（U44402）设计并合成部分NS5基因上游和下游引物(由上海生工生物技术公司合成)，其序列分别如下，NS5U：5′-GAATACATATGACGGAGACTGAAGACTC
AGA-3′，相当于6771～6790nt，含NdeⅠ切点；NS5D：5′-GAGCTCGGATCCCGGAGTGCGCACCT-3′，相当于7291～7304nt，含BamHⅠ切点。
RT-PCR：异硫氰酸胍法从血浆中提取病毒核酸。用上述引物以RT-PCR扩增HGV NS5基因：42℃反转录50min，PCR反应条件为：94℃ 30s，59℃ 1min，72℃ 1min，共30个循环，最后72℃延伸7min。
扩增基因的克隆与核苷酸分析：将上述PCR获得的基因片段按常规方法克隆于pRSET A，获得重组质粒HGV NS5/pRSET A，经NdeⅠ和BamHⅠ双酶切及EcoRⅠ单酶切分析后，由赛百盛公司完成克隆基因的序列测定。
表达载体的构建：重组质粒HGV NS5/pRSET A，经NdeⅠ和BamHⅠ双酶切后，回收NS5基因片段，插入pPROEX-1载体，构建重组表达质粒HGV NS5/pPROEX-1。
诱导表达：将带有HGV NS5/pPROEX-1重组表达质粒的DH5α新鲜过夜培养物按1∶100接种LB液体培养基（含100μg/ml氨苄西林钠），37℃摇床培养至A600=0.5，加IPTG至终浓度0.5mmol/L，继续培养4h，用12%SDS-PAGE对培养物进行分析。
表达蛋白的纯化：以Ni-NTA亲和层析进行纯化〔5〕。
Western-blot分析：纯化后的蛋白产物进行SDS-PAGE，转NC膜，水漂洗，3% H2O2处理30min，5%脱脂奶粉封闭1h，1∶5稀释的HGV抗体阳性血清与膜结合4h，PBS漂洗，1∶40兔抗人IgG酶结合物结合1h，漂洗后置新配的DAB溶液中显色。
EIA检测血浆样本：以适当浓度纯化的NS5蛋白产物为抗原包被酶标板，1%牛血清白蛋白封闭后，加入1∶10稀释的待检样品，37℃孵育1h，加入羊抗人IgG酶结合物，37℃反应1h，加OPD底物液显色20min，以上各操作步骤间用PBS洗3遍。用1mol/L硫酸终止反应后，490nm波长测定吸光值。检测100份抗HCV阳性血浆及240份健康献血员血浆，Cut off值=阴性标本A490×2.1。
结果
1.HGV NS5基因的克隆与限制性内切酶鉴定：以HGV RNA阳性血浆中的病毒RNA为模板，NS5U和NS5D为引物，经RT-PCR扩增获得了预期的约550bp大小的片段，以NdeⅠ和BamHⅠ双酶切，插入到pRSET A相应酶切位点间，重组质粒分别用NdeⅠ和BamHⅠ双酶切和EcoRⅠ单酶切鉴定，均能切出预期大小的片段（图1）。
| 图1 HGV NS5/pRSET A及内切酶鉴定
Fig 1. Analysis of HGV NS5/pRSET A by restriction endonuclease digestion 1. Marker:λDNA/HindⅢ；2. pRSET A digested by NdeⅠ & BamHⅠ；3. HGV NS5/pRSET A digested by NdeⅠ & BamHⅠ；4. pRSET A digested by EcoRⅠ；5. HGV NS5/pRSET A digested by EcoRⅠ；6. Marker:100bp DNA ladder 2.克隆序列的核苷酸及氨基酸分析：克隆载体上的外源基因经测序，没有发生移码突变，框架正确，可用于表达（图2， GeneBank AF169028）。该段基因（暂称为河北株）保守性较高，与河南株、北京株、美国株和西非株的对应序列相比较，核苷酸同源性为91%～95%，而且75%以上的变异都发生在第三位编码子上，因此氨基酸的同源性更高（表1）。 表1 克隆序列与部分毒株相应序列的同源性比较 Table 1. Homology of partial nucleotide and amino acid of HGV NS5 between Hebei strain and the compared HGV strains |
| Virus strain | Homology of
nucleotide acid |
Homology of
amino acid |
| U75356（Henan） | 91.95% | 94.34% |
| U94695（Beijing） | 95.32% | 99.37% |
| U44402（USA） | 91.01% | 96.23% |
| U36380（Africa） | 93.45% | 96.23% |
| 3.HGV NS5/pPROEX-1表达载体构建：从重组克隆载体上以NdeⅠ和BamHⅠ切下基因片段，插入pPROEX-1的NdeⅠ和BamHⅠ位点间，筛选重组质粒，NdeⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定，有约530bp片段切出的为阳性重组质粒。EcoRⅠ进一步单酶切，切出约450bp片段，证明有NS5基因插入（图3）。 |
图2 HGV NS5克隆序列的测序结果
Fig 2. Nucleotide sequence of partial HGV NS5
图3 HGV NS5/pPROEX-1及其酶切鉴定
Fig 3. HGV NS5/pPROEX-1 and its identification by restriction endonuclease digestion
1. pPROEX-1；2-3. Recombinant HGV NS5/pPROEX-1；4. pPROEX-1 digested by NdeⅠ & BamHⅠ；5. HGV NS5/pPROEX-1 digested by NdeⅠ & BamHⅠ；6. HGV NS5/pPROEX-1 digested by EcoRⅠ & BamHⅠ；7. Marker:100bp DNA ladder
4.HGV NS5蛋白的表达与纯化：重组表达质粒转化的E.coli DH5α，经IPTG诱导后，表达相对分子质量(Mr)约20×103的可溶性蛋白。经Ni-NTA亲和层析纯化，纯度约30%（图4a）。
5.Western blot分析：经抗HGV阳性血浆进行Western印迹分析，结果可见特异性印迹（图4b）。
图4 重组HGV NS5蛋白质的表达、纯化及鉴定
Fig 4. Expression, purification, and identification of recombinant HGV NS5
1. Purified expressed protein by Ni-NTA affinity chromatography；2,5. Different DH5α strain which expressed HGV NS5 protein，not purified；3,4. HGV NS5/pPROEX-1/DH5α, no induction；6. Low range protein standard
6.EIA检测血浆样本
血清（浆）稀释度的确定：以RT-PCR及HGV合成肽EIA检测试剂鉴定为HGV阳性的一份血浆作为阳性参考品，以RT-PCR 及HGV合成肽EIA检测试剂鉴定为HGV阴性的10份血浆混合后作为阴性参考品，阴、阳性参考品均为HBsAg阴性、HCV、HIV抗体阴性。以适当浓度的HGV-NS5重组抗原包被酶标板后，加入1∶5、1∶10、1∶20、1∶50、1∶100稀释的参考血清，结果表明以1∶10稀释时，获得的阳/阴性比值最高（表2）。
表2 不同稀释度HGV阴、阳性血清的吸光值
Table 2. A490 of serial diluted HGV negative / positive plasma
| Plasma titer | 1∶5 | 1∶10 | 1∶20 | 1∶50 | 1∶100 |
| Positive plasma (P) |
0.735 |
0.680 |
0.405 |
0.310 |
0.105 |
| Negative plasma (N) | 0.152 | 0.139 | 0.110 | 0.082 | 0.053 |
| P/N value | 4.8 | 4.9 | 3.7 | 3.8 | 2.0 |
对100份HCV阳性血浆及240份HCV阴性血浆检测的结果表明（表3），抗HCV阳性血浆的抗HGV NS5检出率显著高于健康献血员血浆，抗HCV阳性者感染HGV的危险性是健康献血员的3.6倍。提示HGV与HCV可能有相似的传播途径。
表3 HCV抗体阳性者及健康献血员中HGV-NS5抗体的阳性率
Table 3. Anti-HGV NS5 detected rate in anti-HCV positive persons and healthy plasma donors
| Group | Tested No. | Anti-HGV NS5
positive case |
Anti-HGV NS5
detected rate |
| Anti-HCV positive
persons |
100 | 15 | 15.0% |
| Healthy plasma
donors |
240 | 10 | 4.2% |
χ2=12.16，P=0.005，RR=3.6
讨论
目前HGV感染的实验室检测主要依靠RT-PCR方法，但其操作繁琐，不适用大规模的流行病学调查及常规的临床检测。国内现有的HGV抗体检测试剂多为人工合成肽抗原，由于肽段的空间构像与天然蛋白质的空间结构有可能不完全一致，因此对检测结果可能有一定的影响。Tacke M等（德国）用CHO细胞表达的HGV E2抗原试制了检测E2抗体的EIA试剂，欧美一些国家临床应用的结果表明，E2抗体的检测结果与RT-PCR检测结果的符合率不象人们所期望的那么高，且E2抗体的出现往往伴随着病毒血症的消失，这说明HGV不同于HCV，它在人体的感染及复制与HCV有较大的差异，HGV的感染可能具有自限性，因此，HGV E2抗体检测用于既往感染的调查较为合适。
对HGV编码的多肽用计算机进行综合分析的结果表明，其NS5区的抗原性最强。它在感染的早期就有表达，血清中抗体的产生也先于E2抗体，因此，NS5抗体检测可能是替代HGV RT-PCR的较好选择。计算机模拟实验的结果显示，HGV-NS5蛋白的疏水性强，如表达时不形成包含体，对大肠杆菌将具有较强的毒性。实验时，我们试用了目前国内常用的多种高表达系统（如pRSET A、pET 11a、pET 3a、pBV220），表达HGV-NS5均告失败，证明了计算机预测的正确性。
本研究成功表达的HGV-NS5载体不是常用的表达载体，表达量较低，为带有6个组氨酸的可溶性融合蛋白，可用金属离子鳌合层析进行纯化。HGV-NS5的成功表达为我们进一步研究其在感染过程中的作用提供了方便，为建立检测HGV-NS5抗体的血清学方法奠定了基础。根据以往对HCV研究的经验，NS5蛋白对病毒是一种具有重要功能的蛋白，在HGV的生活史中，NS5蛋白可能也扮演重要角色，研究其相应抗体的变化，有助于揭示NS5蛋白的功能。克隆基因的测序结果表明，该段基因保守性较高，与河南株、北京株、美国株和西非株的对应序列相比较，相互间的氨基酸变异并未影响这几个主要抗原决定簇（EDSEL，ESSSDEKT，SQEDTPS，DTAESEE，DATR）。因此，该表达蛋白用于EIA试验检测血样可能有较好的代表性，与机体针对不同毒株产生的抗体都可能有结合活性，适于作为EIA方法的包被抗原。利用我们表达的HGV NS5抗原组装的EIA试剂检测HCV抗体阳性血浆，抗HGV NS5抗体阳性检出率为15%（15/100），而健康献血员血浆中HGV NS5抗体的阳性检出率为4.2%（10/240），与国内曹阳等人报道的结果相近〔6〕，提示HGV与HCV有相似的传播途径，并且在献血员中有较高的感染率。
我们曾用Schlueter等〔7〕介绍的RT-PCR引物及检测方法对176份来自健康献血员的血浆标本进行检测， 共检出5份阳性；而用HGV-NS5 EIA检测出阳性标本7份，二者均判为阳性的3份，均判为阴性的共167份，据此结果计算两种检测方法的符合率为96.6%。由于目前我们未能获得足够数量的HGV阳性血清标本，因此，无法对HGV-NS5 EIA检测试剂与RT-PCR间的一致性作出客观准确的结论，但从理论上可以推测，它与RT-PCR的一致性会优于 HGV E2抗体检测。
参考文献
1，Simons JN, Leary TP, Dawson GJ, et al. Isolation of novel virus-like sequences associated with human hepatitis. Nat Med, 1995, 1:564-569.
2，Linnen J, Wages J Jr, Zhang-Keck ZY, et al. Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus: A transfusion transmitted agent. Science, 1996, 271:505-508.
3，Alter HJ, Nakatsuji Y, Melpolder J, et al. The incidence of transfusion-associated hepatitis G virus infection and its relation to liver disease. NEJM, 1997, 336:747-754.
4，Pilot-Matias TJ, Muerhoff AS, Simons JN, et al. Identification of antigenic regions in the GB hepatitis viruses GBV-A, GBV-B and GBV-C. J Med Virol, 1996, 48:329-338.
5，Polayes D, Hughes J. Efficient protein expression and simple purification using the pPROEX-1TM system. Focus, 1994,16:81-84.
6，曹阳，程云，张建荣, 等. 北京地区部分人群血清中抗庚型肝炎病毒抗体的检测. 中华实验和临床病毒学杂志, 1996, 10（3）:279-281.
7，Schlueter V, Schmolke S, Stark K, et al. Reverse transcription-PCR detection of hepatitis G virus. J Clin Microl, 1996, 34:2660-2664.
(收稿日期：1999-08-05)