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中药抗病毒胶囊对Ⅱ型单纯疱疹病毒作用的电镜观察
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第4期第20卷 病毒学
作者：范瑞强 谢长才 郖国维 雷娓娓 吴玲霓
单位：范瑞强 谢长才 郖国维（广东省中医院皮肤科）；雷娓娓 吴玲霓（广州中医药大学电镜室）
关键词：抗病毒胶囊；单纯疱疹病毒；电镜；负染技术
【 摘要 】 目的 探讨抗病毒胶囊治疗生殖器疱疹的作用机理。 方法 运用透射电镜采用负染方法，观察药物与单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-Ⅱ）相互作用后病毒颗粒形态改变情况。 结果 病毒颗粒变形，大小不均匀，包膜裸露或破损以及病毒颗粒凝集融合成块，结构模糊不清。 结论 抗病毒胶囊在体外对HSV-Ⅱ病毒颗粒的形态结构、表面成分和分散均有显著破坏作用。
Electron microscopic observation on the function of the antiviral capsule of traditional medicines on herpes simplex virusⅡ
FAN Ruiqiang, XIE Changcai, XUAN Guowei
（Department of Dermatology, Guangdong Hospital of TCM, Guangzhou, P.R.China）
【 Abstract 】 Objective To study the mechanism of the antiviral capsule of traditional medicines in treating genital herpes. Methods Using the transmission electron microscope, we observed the morphologic change of the viral particles with negative staining after the interaction of the capsule and herpes simplex virusⅡ. Results The results showed that the viral particles deformed, and the sizes the particles were not uniform, the envelopes were denuded or damaged. The viral particles were fused into masses, and the structure was blurred. Conclusion
The antiviral capsule has significant damaging effect on the morphosis, superficial components and dispersion degree of the viral particles.
【 Subject words 】 Antiviral capsule; Herpes simplex virus; Electron microscope; Negative staining
抗病毒胶囊是本院皮肤科研制的中药制剂，临床用于治疗复发性生殖器疱疹的随机对照研究结果显示，其疗效的初步资料基本等同于无环鸟苷片剂，并且体外抗病毒作用实验证实，抗病毒胶囊有较好抗Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-Ⅱ)的作用。最近，我们将药物与HSV-Ⅱ相互作用后用透射电镜观察病毒颗粒形态改变情况，探讨药物抗病毒的作用机理，现将结果报告如下。
材料与方法
药物：抗病毒胶囊1号、2号由广东省中医院制剂室提供，批号为980718、980925，配制成含生药1g/ml的水煎液，除菌过滤，4℃保存备用（其中胶囊1号的主要药物有板蓝根、虎杖、红条紫草、茵陈、苍术；胶囊2号的主要药物有黄柏、西洋参、虎杖、黄芪、知母）。
细胞：原代兔肾细胞(PRK)，取自5日龄内的乳兔，剪碎加胰蛋白酶4℃消化过夜。先去胰酶后加入生长液置37℃、5% CO2孵箱中培养3d，待长至单层后使用。
病毒：单纯疱疹病毒(HSV-Ⅱ)，由湖北医科大学病毒研究所提供。取病毒液0.1ml加入长至单层的PRK细胞瓶内，放于37℃、5% CO2孵箱中观察，当细胞均出现病变（变圆、胀大时），分装于5ml离心管，先3000r/min离心，取上清液，再进行15000r/min离心，取沉淀物制成悬液待用。病毒悬液的滴度为106.67TCID50。
药物制备：用兔肾细胞毒性试验测知，抗病毒胶囊1号的细胞最大耐受浓度为1.5625mg/ml，中毒浓度为6.25mg/ml；抗病毒胶囊2号的最大耐受浓度为3.125mg/ml，中毒浓度为6.25mg/ml。将抗病毒胶囊1号、2号配制成3.125mg/ml(1∶32)，1.5625mg/ml(1∶64)，0.78125mg/ml(1∶128)3种无毒浓度，分装5ml离心管中，3000r/min离心，去掉沉淀物，上清液待用。
电镜观察：采用负染技术，先将纯化后的病毒悬液与等量的上述3种浓度的药液混合，放于37℃孵箱中孵育5min，然后进行3%磷钨酸负染色、上铜网，JEM-1200EX透射电镜观察，同时设立正常病毒对照。
结果
1.正常对照组：在负染色透射电镜下见到的HSV-Ⅱ颗粒为圆球形，分散适度，结构完整清晰，大小在150～180nm之间。病毒颗粒中央为电子密度较低或呈透光的核心区，周边电子密度较高，最外层是呈绒毛状的蛋白纤突（见图1）。
图1 正常的HSV-Ⅱ颗粒
Fig 1. The normal HSV-Ⅱ(×15000)
The structure is intact, and the size is between 150～180nm
图2 经3.125mg/ml胶囊1号处理5min的HSV-Ⅱ
Fig 2.HSV-Ⅱwas treated by 3.125mg/ml of activiral capsule 1 for 5 min (×15000)
a. The viron was out of shape
b.The viron become small and the spikes lost
2.药物作用组：经用不同浓度抗病毒1号、2号胶囊处理5min HSV-Ⅱ颗粒在负染色透射电镜下见到病毒颗粒的分布、形态、结构、大小，电子密度均发生了变化。主要表现为(1) 病毒颗粒变形，边缘不规整，大小不均匀（见图2）。(2) 病毒颗粒凝集融合成块，电子密度降低，结构模糊不清（见图3）。(3) 病毒颗粒最外层的绒毛状结构缺失，包膜裸露和破损（见图4）。
表明中药抗病毒胶囊1号、2号在体外对HSV-Ⅱ颗粒的形态结构和表面成分有显著破坏作用。
图3 经3.125mg/ml胶囊1号(a)和2号(b)处理5min的HSV-Ⅱ
Fig 3. HSV-Ⅱ was treated by 3.125mg/ml of activiral capsule 1 (a) and activiral capsule 2 (b) for 5 min(×15000)
a.The viral particles assembled and the structures were deformed after treatment
b.The deforme is similar to a.after treatment
讨论
HSV-Ⅱ属疱疹病毒科病毒，其完整的病毒颗粒呈圆形，直径为180～200nm，主要由三层结构组成：最里面是病毒DNA构成的核心；核心外为一层均质的壳层；最外层为囊膜（又称包膜），在囊膜上有很多蛋白纤突〔1，2〕。病毒是通过与宿主细胞的吸附、进入、脱壳、基因激活、复制增殖而完成一个感染过程〔2〕。因而，病毒颗粒的结构完整和与宿主细胞的吸附，在病毒对宿主细胞感染过程中起着非常重要的作用。
图4 经3.125mg/ml胶囊1号(a)和2号(b)处理5min的HSV-Ⅱ
Fig 4. HSV-Ⅱ was treated by 3.125mg/ml of activiral capsule 1 (a) and activiral capsule 2 (b) for 5 min(×15000)
a. The spikes of the viron lost and the envelope was damaged after treatment
b. The damage is similar to a.after treatment
近年，国内外曾有一些学者进行过药物在体外对乙肝病毒和HSV形态学影响的电镜观察研究。如徐云庆〔3〕观察了14种化学消毒剂对乙肝病毒颗粒的影响，结果乙肝病毒颗粒发生不同程度的裂变、破碎和变形；鲁建华〔4〕、张杰〔5〕等分别观察了广谱抗病毒药和中药石榴皮对HSV-Ⅰ和HSV-Ⅱ形态学的影响，结果显示，病毒囊膜明显破坏和病毒核心模糊消失。本研究应用电镜负染技术观察了中药复方制剂抗病毒胶囊1号、2号在体外对HSV-Ⅱ形态学的影响，结果显示，药物与病毒混合作用5min后，病毒颗粒出现变形、大小不均匀、核心破裂、融合、结构模糊、最外层纤毛缺失和囊膜破坏等形态学上的改变。同一药物，随着药物浓度的增大，上述病毒颗粒受破坏的情况有明显差异；不同的药物，病毒颗粒受破坏的情况无明显的差异。
根据观察结果，我们推测HSV-Ⅱ表面结构和核心区的破坏，影响HSV-Ⅱ与宿主细胞的吸附结合和HSV DNA的复制增殖，可能是中药抗病毒胶囊抗病毒作用机理之一。其详细确切的抗病毒作用机制尚有待于今后作进一步深入研究。
基金项目：国家中医药管理局科研基金资助项目(972077)
参考文献
1，杜平，朱关福，刘湘云主编. 现代临床病毒学. 北京: 人民军医出版社, 1991, 133.
2，黄祯祥主编. 医学病毒学基础及实验技术. 北京: 科学出版社, 1994, P49, P815.
3，徐庆云, 何尚浦, 施侣元. 14种化学消毒剂抗乙肝病毒效果的研究. 同济医科大学学报, 1990, 19(3):164-167.
4，鲁建华, 杨传武, 吴静安, 等. 广谱抗病毒抗生素17977对HSV-I形态学的影响. 中国临床药理学与治疗学杂志, 1998, 3(4):265-267.
5，张杰, 詹炳炎, 姚学军, 等. 中药石榴皮对生殖器疱疹病毒的灭活作用及其机理探讨. 中国人兽共患病杂志, 1996, 12(1):50-52.
(收稿日期：1999-04-14)