自杀基因TK联合细胞因子FL真核表达载体的构建及其相关特性的研究

自杀基因TK联合细胞因子FL真核表达载体的构建及其相关特性的研究

中华微生物学和免疫学杂志 2000年第5期第20卷 基础免疫学

作者：王晓　李梁　冯凯　白慈贤　裴雪涛

单位：100850 北京，军事医学科学院放射医学研究所三室、国家生物医学分析中心

关键词：自杀基因；Flt-3配体；细胞因子；基因治疗

　　【 摘要 】　目的　探讨自杀基因TK（thymidine kinase，胸苷激酶）与细胞因子FL（Flt-3 ligand，Flt-3配体）在同一细胞克隆中表达的特性，为肿瘤的基因治疗提供实验基础。 方法　构建以IRES（内部核糖体进入位点）相连的TK与FL的真核表达质粒，脂质体法转入人乳腺癌细胞株MCF-7中。MTT法检测GCV(Ganciclovir，更昔洛韦)对MCF-7/TK-FL细胞的杀伤活性，电镜、光镜及FACS法检测凋亡情况。ELISA法及Western blot对该细胞克隆分泌的FL进行定量、定性分析并检测其对CD34⁺细胞的促增殖活性。 结果　构建的pIRES-TK-FL真核表达质粒以脂质体法可成功转入MCF-7细胞中，MCF-7/TK-FL细胞可被GCV有效杀伤并存在凋亡情况，IC₅₀值为0.5μg/ml。该细胞分泌的FL有蛋白水平的表达，ELISA法测定FL分泌量为每4天10⁵个细胞中15.7ng/ml，它具有刺激CD34⁺细胞增殖的活性。 结论　MCF-7/TK-FL细胞可同时表达TK与FL基因，在自杀基因瘤苗的基础上，其分泌的细胞因子FL具有生物活性，可作为进一步加强免疫细胞功能的手段。

Construction and characterization of TK/FL recombinant protein

WANG Xiao, LI Liang, FENG Kai, et al.

　　（Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 100850, P. R. China）

　　【 Abstract 】　Objective　To determine the in vitro behavior of simultaneously expressed TK and FL in cells. Methods　A recombinant vector carrying herpes simplex virus thymidine kinase gene (TK), internal ribosome entry site (IRES) and Flt-3 ligand gene (FL) was constructed, and transfected into the MCF-7 tumor cells (MCF-7/TK-FL). FL in the supernatant was detected by ELISA. MTT was adopted to determine the sensitivity of MCF-7/TK-FL cells to GCV (ganciclovir). The apoptosis of cells was monitored using electro-microscope and flow cytometry. Results　MCF-7/TK-FL cells expressed both TK and FL genes simultaneously. Dose-dependent cell killing by a transduction of the HSV-TK gene followed by GCV treatment was observed. Apoptosis was also obvious in the MCF-7/TK-FL cells-GCV system. The amount of FL secreted in culture supernatant of MCF-7/TK-FL cells was 15.7ng/ml from 10⁵ cells during 4 days, as determined by ELISA. The supernatant was able to stimulate proliferation of CD34⁺ cells from human cord blood. Conclusion　MCF-7/TK-FL cells may be used as a experimental vaccine for tumor therapy, they are also valuable in producing large quantity of FL.

　　【 Subject words 】　Suicide gene; Flt-3 ligand; Cytokine; Gene therapy

　　肿瘤的自杀基因疗法首创于1986年。因为采取先转染后治疗的途径，整个基因治疗较容易控制，所以该项措施的研究很快开展起来。目前在美国已批准数项以此方法治疗脑胶质瘤、卵巢癌等的临床方案^〔1〕。FL是酪氨酸激酶Flt-3/Flk-2受体的配基，它是最近发现的一种早期造血生长因子，它在外周血干细胞动员、体外树突状细胞的扩增、癌症的免疫治疗及造血细胞的体外培养中都发挥重要作用^〔2〕。最近有关FL在促树突状细胞增殖方面的研究较多^〔3〕。

　　本研究中，我们构建了pIRES-TK-FL真核表达质粒，以脂质体转染MCF-7细胞，获同时表达TK和FL的阳性克隆，它分泌的FL有刺激CD34⁺细胞增殖的作用。在TK自杀基因疗法中介入FL，可利用FL自身的抗癌作用和对某些免疫细胞的促增殖作用加强多元瘤苗的抗癌效果，是一种细胞因子基因疗法与其它手段相结合的综合治疗途径。

　　材料与方法

　　试剂与材料：质粒：pIRES-neo，tgCMV/HyTK，FL基因片段。细胞株：MCF-7。酶及抗体：NruⅠ、EcoRⅤ、T4连接酶、XbaⅠ、SmaⅠ、BstXⅠ、NotⅠ、BglⅡ、BamHⅠ（ TaKaRa BIOTECH），山羊抗人FL一抗（Santa Cruz），生物素化兔抗山羊二抗IgG、辣根酶标记链亲和素（中山试剂公司）。试剂盒：质粒DNA提取试剂盒（Promega USA），Lipofectin (GIBCO BRL)，Wizard Genomic DNA purification system(Promega USA)，随机引物标记试剂盒(Promega USA)，化学发光试剂盒（Chemilumine science）。

　　pIRES-TK-FL真核表达载体的构建：pIRES-neo质粒用NruⅠ与EcoRⅤ酶切消化完全后，回收4.6kb的大片段，加入T4连接酶使其自身环化（切去了CMV启动子）。环化的pIRES-neo用XbaⅠ、SmaⅠ切开（失去neo），回收的大片段（3.73kb）与EcoRⅤ、XbaⅠ双酶切产物FL片段（570bp）相连，形成pIRES-FL克隆质粒，转化DH5α感受态细菌，筛选阳性克隆，提取质粒DNA，用BstXⅠ酶切鉴定。pIRES-FL质粒用XbaⅠ、BamHⅠ双酶切成2531bp与1779bp两个片段，回收1779bp片段备用；pIRES-FL质粒再用XbaⅠ、NotⅠ双酶切，回收2509bp片段备用；TK基因是由tgCMV/HyTK用BglⅡ、NotⅠ双酶切切下的2900bp片段，将其与上述1779bp、2509bp两个片段用T4连接酶相连，转化DH5α感受态细菌，挑选阳性克隆，提取质粒酶切鉴定。

　　脂质体介导pIRES-TK-FL真核表达质粒转染MCF-7细胞：MCF-7细胞在含10%小牛血清的DMEM中常规培养，转染前一天换液，使细胞融合率达50%～80%。转染前换无血清培养基并冲洗2遍。取pIRES-TK-FL质粒DNA 4μl（0.5μg/μl）和脂质体10μl（1μg/μl），分别加到96μl和90μl无血清培养基中，混匀，室温放置45min。随后将两者合并，迅速混匀，室温放置15min后，加入2ml无血清培养基，混匀后吸入培养瓶，覆盖全部细胞表面，置37℃ 5%CO₂培养箱进行转染，12h后换含10%小牛血清的DMEM继续培养，48h后传代并加潮霉素800μg/ml加压筛选，10～20d筛选出阳性克隆MCF-7/TK-FL细胞。HyTK及FL基因转染MCF-7细胞的方法同前，细胞克隆分别命名为MCF-7/TK及MCF-7/FL。

　　MCF-7/TK-FL基因组DNA的Southern blot鉴定：Wizard Genomic DNA purification system 常规提取MCF-7/TK-FL中的基因组DNA。按《分子克隆》的方法，将基因组DNA用EcoRⅠ酶切过夜，于4℃缓慢电泳，然后采用毛细管转移法将凝胶上DNA转移至硝酸纤维素膜上。转膜结束后，80℃干烤至膜干燥。68℃进行预杂交（6×SSC，5×Denharts，0.5% SDS，变性鲑鱼精DNA）3～4h，然后加入探针杂交24h，充分洗膜后进行放射自显影。MCF-7/TK细胞及MCF-7/FL细胞基因组DNA的Southern blot鉴定方法同上。

　　MTT法检测GCV对MCF-7/TK-FL的杀伤作用：将细胞分成A、B、C、D四组，A组为未转基因的MCF-7细胞；B组为MCF-7/TK细胞；C组为MCF-7/FL细胞；D组为MCF-7/TK-FL细胞。检测前使细胞融合率达70%～80%，将细胞稀释成2×10⁴/ml，在96孔板中每孔加入180μl，同时加入不同浓度GCV(Ganciclovir, 更昔洛韦) 20μl，使终浓度为10^-4～10⁴μg/ml之间，每实验组3个复孔，同时设置对照孔及调零孔。68h后加入MTT 20μl（5mg/ml），4h后弃上清加入DMSO溶解，10min后振荡，上酶标仪以490nm测吸光度(A)值，按下列公式计算细胞生长抑制率：

　　FACS法及电镜分析检测MCF-7/TK-FL/GCV系统中的凋亡现象：将MCF-7细胞、MCF-7/TK细胞、MCF-7/FL细胞及MCF-7/TK-FL细胞均分成A、B 2组。A组不加GCV；B组加GCV 0.5μg/ml。细胞以3×10⁴/孔接种于6孔板，GCV作用4d后以FACS法进行凋亡检测。上述处理的细胞经固定染色后在电镜下观察摄片。

　　Western blot法定性检测FL蛋白：MCF-7/TK-FL细胞上清蛋白质进行SDS-PAGE，电泳至染料抵达分离胶底部时，取下凝胶进行转膜。采用电转移法电转膜2h。转膜结束后进行封闭，然后在膜中加入溶有山羊抗人FL一抗的新鲜配制的封闭液，4℃轻轻振荡2h；用PBS漂洗除去过量的一抗；然后在膜上加入溶有兔抗山羊二抗的封闭液，室温振荡1～2h。取出滤膜，大量漂洗液洗3～5次，用德国宝灵曼的Chemilumine science发光试剂盒检测结果。

　　ELISA法定量测定FL蛋白：在96孔酶标板中，以包被液稀释标准品和上清样品,标准品包被梯度为40ng、20ng、10ng、5ng，待测样品为1/2上清原液，每种浓度设3个复孔。4℃过夜后弃去包被液，每孔加入200μl封闭液（0.01%Tween-20、20%小牛血清）37℃ 2h；弃去封闭液后加入山羊抗人FL一抗100μl共育37℃ 1h，然后用PBS洗2次；加入生物素化的兔抗山羊二抗100μl，37℃作用1h后再用含0.1%Tween-20的PBS洗2次；加入辣根酶链亲和素100μl，37℃作用1h后洗3次；加入OPD显色，有颜色变化即加入终止液，上酶标仪以490nm测定A值，绘制标准曲线，计算样品中的FL含量。

　　MCF-7/TK-FL细胞培养上清刺激人CD34⁺细胞增殖实验：在96孔板中加入5×10³/孔由免疫磁珠分离纯化的CD34⁺细胞，每实验组3复孔，培养液为体积分数12.5%马血清、12.5%胎牛血清、5×10^-7mol/L的氢化可的松的IMDM，加入所需的细胞因子，于37℃ 5%CO₂条件下培养10d后计数。细胞因子每48h添加1次，按细胞因子的不同组合设置7个实验组：① 不加任何细胞因子； ② GM-CSF 40ng/ml； ③ GM-CSF 40ng/ml+标准品FL； ④ GM-CSF 40ng/ml+MCF-7/TK-FL细胞上清； ⑤ GM-CSF 40ng/ml+MCF-7/TK细胞上清； ⑥ GM-CSF 40ng/ml+MCF-7/FL细胞上清； ⑦ GM-CSF 40ng/ml+MCF-7细胞上清。10d后计数细胞增殖数。

　　统计学处理：采用单因素比较的方差分析。

　　结果

　　1.pIRES-neo载体与TK、FL基因片段相连的真核表达质粒的构建：构建中首先切去了pIRES-neo的CMV启动子部分(700bp)，使其自身环化(4600bp)，然后切去了pIRES-neo载体中的neo基因（870bp），使FL（570bp）在此位点便于插入，而且在IRES之后，构建出pIRES-FL质粒（4300bp）。带有CMV启动子的TK片段（2900bp）在多克隆位点处插入，这样启动子之后为TK片段，IRES处于TK与FL之间，便于两个基因的表达。该TK基因片段为Hy-TK的融合基因，保有潮霉素B的抗性，因此切去-neo之后的重组质粒用潮霉素加以筛选，其长度为7188bp。

　　2.Southern blot 鉴定pIRES/TK-FL在MCF-7基因组中的整合：图1所示为MCF-7/TK-FL基因组DNA的Southern blot结果。用α-³²P dCTP同时标记TK和FL片段作为探针，杂交24h后充分洗膜进行放射自显影，压片1周显影清楚。对照组为未转基因MCF-7细胞的基因组DNA，空白组为未加探针的α-³²P dCTP，结果均显示阴性，说明TK与FL已整合入MCF-7基因组中，与PCR结果一致。同样，经PCR和Southern blot 检测HyTK与FL基因也分别转入MCF-7细胞中。

　　3.MTT法检测GCV对MCF-7/TK-FL细胞的杀伤作用：当GCV浓度在10^-4～10⁴μg/ml之间，与细胞共育4d时，可见MCF-7/TK-FL细胞和MCF-7/TK细胞的生长抑制率与GCV浓度之间有剂量依赖性，IC₅₀分别为0.5μg/ml与0.46μg/ml，与未转染的细胞作为对照组相比差异有非常显著性（P＜0.01）。MCF-7/FL细胞组的结果与对照组比较差异无显著性，实验组数据为3复孔平均值±s₍n=3，图2)。

　　图1　MCF-7/TK-FL基因组DNA的Southern blot

　　Fig 1. Southern blot of TK and FL probe

　　Lane 1: MCF-7 genome; Lane 2: MCF-7/TK-FL genome; Lane 3: control without probe

　　图2　GCV对MCF-7/TK-FL细胞的剂量-杀伤率曲线

　　Fig 2. Dose-dependence of in vitro cytotoxicity of GCV

　　4.FACS法及电镜检测MCF-7/TK-FL细胞的凋亡情况：MCF-7细胞、MCF-7/FL细胞、MCF-7/TK及 MCF-7/TK-FL无GCV组细胞均没有检测到明确的凋亡现象，MCF-7/TK细胞和MCF-7/TK-FL细胞经GCV处理组，凋亡率分别为19.3%和20.5%。电镜观察MCF-7/TK细胞及MCF-7/TK-FL细胞经GCV处理后发生凋亡的情况，透射电镜下呈现染色质边集、凝聚，胞膜仍完整，有凋亡小体的形成等现象(图3)。

　　5.MCF-7/TK-FL细胞培养上清中FL的Western blot检测：pIRES/TK-FL中编码FL为分泌性蛋白，收集培养细胞的上清，透析浓缩后与标准品同时加样电泳，化学发光试剂盒检测结果显示，上清样品在与标准品FL蛋白对应位置有一清晰特异性条带，而对照组呈阴性，说明MCF-7/TK-FL细胞培养上清中存在能检测到的蛋白水平FL的表达。

　　6.ELISA法对MCF-7/TK-FL细胞培养上清中FL的定量检测：收集10⁵培养4d的MCF-7/TK-FL细胞上清，包被过夜后依次加入一抗和二抗，以OPD显色，20～30min后即有颜色的梯度变化，以标准品浓度和A值绘制标准曲线，计算公式为：A=0.007X+0.04。通过公式或在曲线上得到相应的MCF-7/FL细胞和MCF-7/TK-FL细胞上清中的FL浓度分别为16.8ng/ml和15.7ng/ml。

　　图3　电镜下的凋亡细胞

　　Fig 3. TEM of apoptotic phenomenon on MCF-7/TK-FL cells (8000×)

　　7.人脐血CD34⁺细胞对FL活性的测定：脐血CD34⁺细胞为早期造血干/祖细胞，表达有FL的受体Flt-3，标准品FL对CD34⁺细胞有促增殖作用。本实验收集各组细胞培养上清，然后在培养CD34⁺细胞时加入，结果未加细胞因子的实验组CD34⁺细胞状态渐差；GM-CSF+MCF-7/TK-FL上清及GM-CSF+MCF-7/FL上清实验组的细胞增殖高于单纯GM-CSF组，但低于GM-CSF+标准品FL组，说明这两组细胞培养上清中的FL具有一定的生物活性，GM-CSF+MCF-7/TK上清与GM-CSF+MCF-7上清组与单纯GM-CSF对照组比较无明显差异，GM-CSF（0.25U/ml）与FL对CD34⁺细胞的增殖有协同刺激作用（图4）。

　　讨论

　　自杀基因疗法可以通过直接杀伤或旁观者效应达到清除肿瘤的目的，目前美国已批准数项与此有关的肿瘤临床治疗方案。为了进一步提高其疗效，该领域的研究又融入了其它手段，结合细胞因子基因疗法即是策略之一^〔4〕。近年来，细胞因子的基因治疗取得了很大进展，广泛涉及几大细胞因子家族^〔5〕。将自杀基因疗法与细胞因子基因疗法结合，可在自杀基因瘤苗的基础上，使细胞因子在微环境中加强免疫细胞的功能，从而使两者协同发挥抗肿瘤作用。

　　图4　人脐血CD34⁺细胞检测MCF-7/TK-FL细胞上清中FL的活性

　　Fig 4. The activity of FL in the supernatant was determined by proliferation CD34⁺ cells

　　我们首先检测转染了TK与FL基因后的人乳腺癌细胞MCF-7/TK-FL对GCV的敏感性，结果发现该细胞可被GCV有效杀伤，并有浓度-杀伤率的剂量依赖性，IC₅₀值为0.5μg/ml，这提示在pIRES-TK-FL真核表达质粒中，FL基因没有影响TK基因的表达，MCF-7/TK-FL细胞-GCV系统具备成为瘤苗的特性，进一步的研究将着重于提高转染效率和加强旁观者效应。另外，在MCF-7/TK-FL细胞-GCV系统中存在明确的凋亡现象。目前，旁观者效应的发生有细胞缝隙连接、细胞凋亡、免疫反应及肿瘤血管内皮细胞坏死等几种机制^〔6〕，凋亡是否为主要机制尚无定论，但凋亡现象的存在将有助于我们探讨自杀基因疗法与免疫功能的关系。有资料表明，体内的抗原递呈细胞如树突状细胞可摄取凋亡小体含有的肽类物质，然后加工递呈给CD4⁺T细胞，进而激活CD8⁺T细胞增殖，扩大其杀伤作用^〔7〕。因此，借助自杀基因系统中的凋亡现象，可进一步加强免疫细胞的功能，从而放大基因治疗的效果。

　　FL作为一种新发现的细胞因子，它具有明确的促树突状细胞增殖的作用和介导免疫系统抗癌的能力^〔8〕。因此，我们在实验设计中选择了细胞因子FL，成功构建pIRES-TK-FL真核表达质粒后，转染人乳腺癌细胞MCF-7，获得的阳性细胞克隆分泌FL，它具有促CD34⁺细胞增殖的能力。在TK自杀基因疗法中介入细胞因子FL，除FL可改变肿瘤的微环境，发挥其自身的抗癌效应外^〔9〕，FL还可对树突状细胞的诱生产生促进作用^〔10〕，这对于加强体内肿瘤抗原的递呈、进一步激活抗瘤效应细胞是至关重要的。

　　总之，结合自杀基因与细胞因子的双重作用，利用好其时效性，对于有效地清除肿瘤，促进基因治疗在临床的实施是很有意义的。

　　基金项目：国家杰出青年科学基金资助项目（39825111）

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(收稿日期：1999-07-30)