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Recombinant hFL-TRAIL gene for colon cancer
张 坤（南京军区福州总医院肝胆外科，福建福州350025）
江 艺（南京军区福州总医院肝胆外科，福建福州350025）
郭光金（第三军医大学基础医学部外科应用解剖与手术学教研室，重庆400038）
左艳芳（第三军医大学基础医学部外科应用解剖与手术学教研室，重庆400038）
［关键词］ 结肠癌;hFL-TRAIL;基因
［中图分类号］R735.35 ［文献标识码］B ［文章编号］1672-5042（2005）06-0417-03
结肠癌是极为常见的消化道恶性肿瘤之一，严重威胁着人类的健康，其发病率与死亡率也有不断上升的趋势。近年来，随着纤维结肠镜的广泛应用，使结肠癌的早期诊断治疗成为可能，同时手术方式的不断改进，术中结肠灌洗等手段的应用，使术后生存时间有所延长，但仍未能取得令人满意的治疗效果。手术治疗作为传统的治疗手段之一，虽可以切除肉眼明显可见的病灶，但无法保证所有的肿瘤细胞都可以被清除干净，而残存的癌细胞则又可以引起肿瘤的复发与转移。放疗、化疗作为手术治疗有力的辅助治疗手段，对清除残留癌细胞，防止肿瘤的复发与转移大有裨益，但因其本身存在的严重的毒副作用及癌细胞对其可能存在的不敏感性或抗药性，使其临床应用受到了很大的限制。在肿瘤治疗的徘徊与迷茫中，生物治疗给人类克服肿瘤的威胁带来了希望。生物治疗主要包括肿瘤的免疫治疗和基因治疗，其理想的机制主要是:①诱导肿瘤细胞自身生长的停滞或凋亡;②提高肿瘤的免疫原性，诱导机体内产生特异性的抗肿瘤免疫反应。为此目的，各国科学家根据现代免疫学发展的新理论，利用细胞免疫和基因工程技术，进行了各种肿瘤疫苗的研究，取得了许多令人振奋的成就。其中FL及TRAIL的抗肿瘤效应研究尤为引人注目。
酪氨酸激酶受体3配体（Flt3ligand，FL）是一种膜蛋白，与SCF、M-CSF有一定同源性，可调节造血干.祖细胞的增殖与分化，并可与多种细胞因子协同，提高造血功能。人类FL基因定位于染色体19q13.3-13.4，含有8个外显子，FL蛋白含有235个氨基酸，由信号肽、胞外区、跨膜区及胞内区组成。FL可促进树突状细胞（DC）、自然杀伤细胞（NK）、细胞毒T淋巴细胞（CTL）的增殖、分化与成熟，发挥其生物学效应，从而表现出抗肿瘤免疫作用。为研究Flt3Ligand是否真正可以及其能在多大程度上促进体内DC的分化与成熟，Eugene对鼠及人类志愿者皮下注射FL后均发现DCs数目的显著增多。循环血液中CD11C+ IL-3Rαlow 及CD11C- IL-3Rαhigh DC前体细胞数目都显著增多，而且CD11C+ DCs又可有效诱导体内T细胞发挥作用，所以认为FL对DCs的数目增多及功能成熟具有重要意义;Shurin等也发现预先应用FL的鼠，从其骨髓或脾脏分离而来的细胞用GM-CSF和IL-4进行培养，可产生大量的DC，同时观察到，给鼠注射FL，可引起其脾脏、骨髓、淋巴结和肝脏内DC的显著积聚;FL与GM-CSF、TNF、IL-4联用，可促进自CD34+ 骨髓祖细胞产生DC，经GM-CSF和TNF-α作用，动员的CD34+ 外周血祖细胞可产生功能尚未成熟的DC，经FL、CD40L等因子作用后，细胞MHC、共刺激分子、粘附分子的表达明显增加，表现为CD8+ CD14- 的活化DC;当FL缺乏时，DC细胞的产生将明显降低。与GM-CSF比较，Flt3Ligand可显著促进CD11C+ CD11b（dull.-）DC的分化增殖，且FL注射鼠体内IL-12水平显著高于IL-10;而GM-CSF则主要促进CD11C+ CD11b+ DC的增殖［3］;Maliszewski的研究也证实FL在体内可显著促进LDCs和MDCs的分化、成熟，并促进其后续的一系列T细胞免疫反应，但在抗肿瘤免疫反应中，如在应用FL的同时联合应用其他细胞因子，如CD40L或4-1BBL等，则会取得更强的抗肿瘤免疫效果［4］。Lynch发现给纤维肉瘤鼠皮下注射FL会导致淋巴组织和非淋巴组织出现大量CD11c+ DEC205+ DC;注射FL不仅可明显降低肿瘤的生长速率，而且可使显著比例的鼠纤维肉瘤完全消失;Esche等利用鼠黑色素瘤（B16及CL8-1）和淋巴瘤（EL-4）模型，也证实了FL的抗肿瘤效应，实验均发现FL的应用可显著抑制肿瘤的生长;Parajuli给BALB.C鼠肿瘤细胞注射前后应用Flt3L注射，均可使DC数目增加，肿瘤的形成与生长受到抑制;也有许多实验证实FL可促进体内淋巴组织与非淋巴组织的DC及NK功能，如人结肠癌细胞皮下注射形成荷瘤鼠动物模型后，应用FL可明显抑制肿瘤的生长并可引起肿瘤的完全消退，80%C3H.HeN鼠在接受剂量为500μg.kg.d的FL10天后，可防止接入的同基因C3L5乳腺癌细胞的生长等;Esche等将FL单独或与IL-12合用，3天后给动物注射肿瘤细胞，以观察肝脏转移瘤的形成，发现FL可显著抑制肝脏转移瘤的形成，病理检查发现肿瘤组织周围明显的淋巴细胞及DC浸润、NK细胞聚集、瘤细胞凋亡的增加。FL与IL-12合用，抗肿瘤效果进一步得到加强。以上均说明FL不仅可降低原发肿瘤的发生，而且可显著抑制肿瘤的转移。DC作为体内最主要的专职抗原递呈细胞，能有力的递呈肿瘤抗原，显著刺激抗原特异性T细胞反应，在肿瘤的免疫治疗中发挥重要的作用。而FL又可显著促进DC的分化、成熟与抗原递呈功能，所以国内外学者一直致力于FL抗肿瘤临床应用的研究。目前已有报道完成FL的原核表达与真核表达，并努力尝试将这些表达载体用于恶性肿瘤的治疗研究;但对于Flt3Ligand用于人胃肠道恶性肿瘤尤其是结肠癌的治疗，目前尚未见系统报道。
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（Tumor Related Apoptosis Inducing Ligand，TRAIL）是肿瘤坏死因子家族成员之一，于1995年由Wiley等发现，是一种II型跨膜蛋白。人类TRAIL基因定位于染色体3q26.1-26.2，cDNA全长1.05kb。TRAIL可在胎盘、胎儿肺、肝、肾及成人脾、胸腺、前列腺、卵巢、小肠、结肠、心肌、肺等组织中表达。TRAIL通过与靶细胞膜相应的受体结合而发挥作用。目前发现的TRAIL受体主要有:1、死亡受体:TRAIL-R1（DR4）和TRAIL-R2（DR5）;这两种受体均含有死亡结构域，可通过死亡信号的传导而诱导靶细胞的凋亡;2、诱骗受体:TRAIL-R3（DcR1）和TRAIL-R4（DcR2），TRAIL与诱骗受体的结合，可使靶细胞逃逸TRAIL所诱导的细胞凋亡;3、OPG（Osteo-protegerin）。TRAIL在细胞内合成后镶嵌在细胞膜上通过相应的蛋白酶作用，形成游离的水溶性的形式并聚合成同源三聚体，与靶细胞膜上特异的死亡受体结合，通过其下游的受体结合分子向细胞内传递死亡信号，最后通过Capase引起细胞的凋亡。然而，由于TRAIL死亡受体主要分布于肿瘤组织，而诱骗受体主要分布于正常组织，所以TRAIL的细胞毒性作用对肿瘤细胞有效，而正常组织细胞则可耐受TRAIL的细胞毒性，这种 凋亡诱导作用呈现时间和剂量的依赖性。TRAIL抗肿瘤的生物学效应已经引起人们的浓厚兴趣，虽然对其研究刚刚起步，却已经有了一些振奋人心的发现。Fanger等将人外周血CD11+ DC用IFN-α或IFN-γ培养后，发现CD11+ DC可明显表达TRAIL，并可使这些DC获得较强的杀伤TRAIL敏感肿瘤细胞的能力，同时对TRAIL不敏感细胞却不表现细胞毒性［9］。也有学者发现，无论是CD34+ 干细胞来源的DCs，还是CD14+ 单核细胞来源的DCs，在其未成熟阶段，均可表达TRAIL，并表现出对TRAIL敏感肿瘤细胞的明显杀伤作用，这种TRAIL表达及肿瘤细胞杀伤作用一直持续至DCs的成熟，并且当用IFN-β对这些未成熟阶段DCs给予刺激时，其TRAIL表达显著上调。体内实验也表明，对荷瘤动物应用重组的TRAIL蛋白能够明显抑制肿瘤细胞的生长，甚至可使肿瘤完全消退，而对宿主没有明显损害，不会引起机体的广泛损伤;而CD95L和TNF-α则容易引起机体肝脏组织的变性、坏死、出血、甚至导致机体的最终死亡，这也反映出TRAIL与其同家族其他因子比较所具有的优势。在接种肿瘤细胞的同时，多次注射TRAIL蛋白，可以明显抑制肿瘤细胞的生长，甚至使肿瘤完全消退。但TRAIL蛋白注射后，因药代动力学作用，很快就会被机体清除，使大部分TRAIL蛋白不能到达肿瘤组织发挥有效的抗肿瘤作用。在肿瘤组织局部注射TRAIL蛋白虽可避免以上问题，但临床应用中只适合于体表或器械容易到达部位的肿瘤，还是受到一定的限制。所以，应用TRAIL基因进行肿瘤的基因治疗，使TRAIL基因在体内获得稳定的表达和抗肿瘤效应，是肿瘤治疗的有巨大潜力的途径。Kagawa等学者构建了含TRAIL基因的腺病毒载体，用其进行恶性肿瘤细胞的体外和体内转染，发现被转染的人肺癌细胞A549，H460均表现出明显的细胞凋亡，种植瘤的体积也显示明显的缩小，而TRAIL基因的转染未表现对机体心、肝、肾等重要脏器的明显毒副作用;Griffith等将TRAIL基因应用腺病毒载体局部肿瘤瘤体内注射转染人乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、黑色素瘤细胞内后，发现这些恶性肿瘤细胞都很快产生TRAIL蛋白，引起细胞的后续凋亡。认为TRAIL基因的肿瘤细胞转染是一种有效的肿瘤基因治疗手段，并且瘤体内的TRAIL基因腺病毒载体内注射，也是一种有效的基因转染手段。
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