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我国登革2型病毒prM基因与甲病毒载体重组RNA的构建
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第5期第20卷 病毒学
作者：于曼 秦鄂德 欧武 段鸿元 杨佩英
单位：军事医学科学院微生物流行病研究所病毒室
关键词：登革2型病毒；prM基因；甲病毒载体；重组RNA
【 摘要 】 目的 将我国登革2型病毒的prM（D2-prM）基因导入甲病毒载 体（pSfV），研究该基因及其编码蛋白介导的抗病毒作用。 方法 首先将扩增的病毒prM基因导入pSfV的Sp6启动子下游并进行核苷酸序列测定。用SpeⅠ酶将p SfⅤ-prM重组DNA线形化，再将其体外转录成5′末端含帽子结构的重组RNA。然后通过电穿 孔法将此重组RNA转染BHK-21/13细胞。采用X-Gal原位染色和免疫荧光法对转染细胞的表 达产物进行分析。 结果 通过碱基序列测定证明病毒的prM基因已 插入到甲病毒载体中，而且其重组DNA的转录物经RNaseA消化证实为RNA。重组RNA的细胞转 染率达90%以上。prM蛋白表达细胞约占80%。 结论 由pSfV-prM R NA转染哺乳动物细胞所产生的蛋白可与登革2型病毒多克隆抗体起特异反应，证明体外转录 的重组RNA含有登革2型病毒特异序列。
Construction of the recombinant RNA of Chinese Dengue 2 virus prM gene-alphavir us vector
YU Man, QIN Ede, OU Wu, et al.
（Department of Virolog y, Institute of Microbiology and Epidemiology, AMMS, Beijing 100850, P.R.China）
【 Abstract 】 Objective The aim of this study is to insert the premembrane (prM) gene of the Chinese Dengue 2 virus into the alphavirus vecto r (pSfV) and to investigate the prM gene-and its encoding protein-mediated res istance to Dengue virus. Methods The amplified prM gene w as cloned into the Sp6 promoter downstream of pSfV vector and its nucleotide seq uence was determined. The recombinant plasmid DNA was linearized by the enzyme S pe I digestion and transcribed in vitro into recombinant RNA which contained the capping analog on its 5′-end. Then the BHK-21/13 cells in vitro was transfected with synthesized RNA by electroporation. Analysis of the expressed p roducts in transfected cells was performed with in situ X-Gal staining and immu nofluorescence technique. Results The nucleotide sequence assay of the fragment inserted in the recombinant plasmid DNA indicated that th e viral prM gene had been cloned into the alphavirus vector. Assay with RNase A digestion showed that in vitro the synthesized transcripts from the recombin ant pSfV-prM DNA was RNA. Transfection efficiency of the pSfV-prM RNA was grea ter than 90% and the number of positive cells expressing prM protein was 80%. [ WT5”HZ〗Conclusion The expressed protein in mammalian cells transfe cted with the recombinant pSfV-prM RNA can react with polyclonal antibody again st Dengue 2 virus, indicating that the in vitro-transcribed recombinant RNA contains specific nucleotide sequence of Chinese Dengue 2 virus strain.
【 Subject words 】 Dengue 2 virus; prM gene; Alphavirus vector; Recombinant RNA
据报道，全世界每年约有1亿登革热和25万登革出血热患者〔1〕。但目前对这类蚊媒 病毒病仍无有效的防治措施。登革疫苗的研究已有50年的历史，至今尚未取得大的进展 〔2，3〕。近年来的研究表明，通过病毒载体释放特异基因来介导抗病毒作用的途径，可 避免由采用基因表达蛋白进行疫苗研究所出现的许多问题。尤其是新近研制成功的由Semlik i森林病毒(Semliki forest virus) 改构而成的虫媒甲病毒载体系统（pSfV），其宿主细胞 谱广、转录和释放外源基因的效率高。并且，用此载体构建的重组病毒颗粒或其重组RNA均 可直接作为免疫原，以病毒自然感染的方式提呈抗原，使宿主产生很强的B细胞和T细胞免疫 应答〔4，5〕。
登革病毒的prM蛋白是病毒编码的三种结构蛋白中的一种糖蛋白，在病毒复制的晚期进 一步被宿主细胞的蛋白酶裂解去除N端的Pre区变成非糖基化的膜蛋白（M）而参与病毒的组 成〔6〕。prM蛋白有多种抗原表位。Pre区具有与抗病毒免疫有关的抗原结构功能区 ，C端为疏水的跨膜结构区，易与宿主的细胞结合，是一种良好的结合性抗原。在4个型的登 革病毒中prM基因的核苷酸序列同源性很高。本研究将我国登革2型病毒43（D2-43）株的pr M基因导入甲病毒载体系统，研究该基因及其编码蛋白介导的抗病毒作用。
材料与方法
毒株和抗体：D2-43株病毒由本室从广西登革出血热患者血清中分离。该毒株的鼠免 疫腹水抗体由本室制备。羊抗鼠IgG荧光抗体为北京挚诚生物工程研究所产品。
甲病毒载体和宿主细胞株：甲病毒载体pSfV为GIBCO/BRL产品。BHK-21/13细胞株由 本所细胞库提供，该细胞于含5%小牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，10mmol/L Hepes，10% trypt ose phosphate broth和1%青、链霉素的DMEM培养基中，置37℃培养至单层。
全长prM基因的PCR扩增：根据D2-43株的prM基因序列设计上、下游引物。上 游引物（病毒基因组的400～421nts）：5′-GATC GGATCCGCAGGCGTGATTATTATGTTGA-3′； 下游引物（945～966nts）：5′-GATC GGATTCGTCTCTATTTGATATTCCTATG-3′（划线处为所加的碱基及BamHⅠ 酶切位点）。以我国D2-43病毒株的RNA为模板，采用RT-PCR方法扩增全长的prM基因。PCR 扩增条件为：94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 2min扩增25个循环，最后于72℃延伸7 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后置-20℃备用。
pSfV-prM重组RNA的构建及鉴定
1.重组质粒DNA的构建：将扩增的prM基因首先插入pBluescript SK+ T载体中，再用BamH Ⅰ酶从T载体上切下prM基因片段，经琼脂糖电泳回收纯化，然后将该片段克隆到pSfV载体的 Sp6启动子下游的BamHⅠ位点。pSfV-prM重组质粒的构建见图1。
2.prM基因插入方向的判定：为了确定prM基因插入到病毒载体中的方向，首先根据pSfV载 体中多克隆位点上游的序列设计一条测序引物：5′-TGCGTTAATACACAGAATTCTGA-3′。重 组DNA中插入片段的核苷酸序列，用ABI PRISMTM 377 DNA sequencer仪，由上海生工 生物工程公司进行测定。
3.重组RNA的制备：4种NTP，帽子结构类似物m7G （5′）ppp（5′）G和Sp6 RNA聚合酶 均为GIBCO/BRL公司产品。重组pSfV-prM质粒DNA用SpeⅠ酶于37℃消化1h，使之线形化后 ，加入酚/氯仿进行纯化。体外转录反应，含4种混合的10mmol/L的NTP，10mmol/L m7G（5 ′）ppp（5′）G帽子结构类似物，10mmol/L DTT，50U RNA酶抑制剂，1.5μg的线性化重 组DNA和38U的Sp6 RNA聚合酶，总体积50μl。
图1 pSfV -prM重组DNA质粒的构建
Fig 1. Construction of a recombiant pSfV-prM plasmid
Sp6: The bacteriophage Sp6 promoter; nsp1-4：Nonstructural protein encoding g enes of Semliki forest virus; LacZ: β-galactosidase encoding gene
于37℃反应2h。RNA转录物可用RNaseA消化加以鉴定。
重组RNA的转染与表达：采用Bio-Rad公司的Gene PulserⅡ型电穿孔仪，将体 外转录的重组RNA转染BHK-21/13细胞。转染条件为：2×107BHK-21/13细胞，6μg重组R NA，850V，25μF，300Ω，脉冲2次。将转染重组RNA的细胞接种于35cm2细胞瓶中，置37 ℃培养。于转染后30min和2h分别向培养基中加入100mmol/L KCl，然后继续培养至24、 48和72h并分别收取细胞进行检测。
表达产物的检测：
1.原位染色法：收取转染后24h的细胞，先用含Ca++和Mg++的PBS洗单层细 胞1次。加入1ml固定液（2%甲醛-0.05%戊二醛），室温放置5min，弃去固定液，再用PB S洗2次。加入X-Gal染液(1mg/ml X-Gal、5mmol/L的铁氰酸钾和亚铁氰酸钾、2mmol/L MgC l2)，于37℃作用2h，弃去染液，用PBS洗细胞2次。于倒置显微镜下观察，阳性转染细 胞为蓝色。
2.免疫荧光法：分别将转染后24、48和72h收获的细胞配成50万/ml的细胞悬液，滴到已 处理好的抗原玻片孔内，50μl/孔，置37℃湿盒内5h使细胞贴壁。取出玻片于PBS液中漂 洗，室温晾干。然后置冷丙酮中于-20℃固定30min，取出玻片晾干。再按常规方法用D2- 43病毒株免疫的鼠腹水抗体为第一抗体进行间接免疫荧光染色，观察病毒蛋白抗原的表达。
结果与讨论
1.扩增的全长prM基因的鉴定：以D2-43病毒株的RNA为模板，采用RT -PCR方法扩增的prM基因片段，两端各含有1个BamHⅠ酶位点。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电 泳与标准分子质量比较，其大小约为560bp，与预期的相一致。将该片段纯化后克隆到T载体 中，用M13通用引物进行核苷酸序列测定，结果证实扩增的片段是登革病毒的prM基因序列， 与本实验室已发表的是一致的〔7〕。
2.pSfV-prM重组RNA的构建与鉴定：将用BamHⅠ酶从T载体上切下的pr M基因插入甲病毒载体pSfV的Sp6启动子下游的BamHⅠ位点，然后转化E.coli DH5α宿主 菌。用PCR和酶切法筛选出阳性重组病毒质粒12株。对其中2株的插入片段进行核苷酸序列测 定，证明其中1株的外源片段为正向插入（见图2）。而且其核苷酸序列与D2-43病毒株的pr M基因序列一致。将重组的质粒DNA线形化之后，在帽子结构类似物m7 G（5′）ppp（5′ ）G的存在下，用Sp6 RNA聚合酶将其体外转录成5′末端含帽子结构的RNA。体外转录物经琼 脂糖电泳证明其大小为2.7kb，与预期的是一致的。对体外转录产物进一步用RNaseA消化， 表明该转录物为RNA（见图3）。为了获得足量的重组RNA，在进行体外转录时，线形化的重 组DNA量不能低于1.5μg。
图2 pSfV-prM重组DNA中prM基因的核苷酸序列测定
Fig 2. Nucleotide sequence assay of the prM gene in the recombinant pSfV-prM pl asmid DNA
The inserted fragrment locates between BamH Ⅰ sites
图3 体外 转录的pSfV-prM重组RNA的鉴定
Fig 3. Identification of the recombinant pSfV-prM RNA transcribed in vitro
1, 2: In vitro transcripts of the pSfV-prM with RNaseA digestion； 3, 5: Th e recombinant pSfV-prM DNA with RNaseA digestion； 6, 7: In vitro transcrip ts of the pSfV-prM without RNaseA digestion； 4: λ DNA Hind Ⅲ marker
3.prM基因的表达：将体外转录的重组RNA用电穿孔法转染BHK-21细胞 进行prM蛋白的表达。分别对转染后24、48和72h的细胞进行蛋白表达水平检测。经X-Gal 原位染色和SDS-PAGE分析，电穿孔的RNA转染阳性率达90%以上（见图4B）。pSfV载体表达 系统在BHK-21等哺乳动物细胞中具有分泌蛋白质的功能。在转染后48h收获的细胞及其培 养上清中均有高水平的蛋白表达，经凝胶薄层层析扫描，上清中蛋白的表达量约占细胞总蛋 白的30%（图5中的条带3和4）。实验中发现，影响外源基因表达有以下几个因素：首先，重 组RNA的转染率要高。当转染效率低于90%时，未转染细胞迅速分裂，其生长速度超过转染的 阳性细胞，而导致阳性细胞数量减少，使特异蛋白的表达量降低。其次，培养基中是否含有 K+对蛋白的表达有很大影响。据报道，在甲病毒感染细胞的培养基中加入适量的KCl可提 高2～4倍的蛋白表达〔8〕。Garry的研究表明，甲病毒感染体外培养的哺乳动物细胞 后，选择性地关闭宿主特异蛋白的合成，而导致总蛋白的合成率降低。这可能与细胞内的K +浓度瞬时降低有关。因为甲病毒可抑制与细胞膜结合的Na+/K+ ATP酶活性，因此， 在培养基中加入适量KCl可提高转染细胞中的K+浓度，从而有利于蛋白质的合成。另外，R NA转染后，KCl加入的时间对蛋白表达影响也很大，转染后30min向培养基中加入100mmol/ L KCl，比转染后21h再加入KCl的蛋白表达量高。但培养基中KCl的浓度超过200mmol/L时则 对细胞产生毒性。此外，所加KCl的浓度和时间，应根据所选用的细胞种类的不同而有所差 异。
图4 pSfV -prM RNA转染BHK细胞的X-Gal原位染色结果
Fig 4. Identification of the BHK cells transfected with pSfV-prM RNA by i n situ X-Gal staining (50×)
At 24 h post-transfection, cells were stained by X-Gal
A. Normal BHK-21 cells
B. BHK-21 cells transfected with pSfV-LacZ RNA
图5 pSfV-prM重组RNA表达产物SDS-PAGE分析
Fig 5. Analysis of the expressed products in the recombinant pSfV-prM RNAs by S DS-PAGE
M. Molecular weight marker；1. Normal BHK cell lysates；2 and 8. Lysates of cell s containing vector pSfV3 RNAs at 24 h and 48 h post-transfection；3 and 4. Sup ernatants of cells containing the recombinant pSfV-prM RNAs at 48 h post-trans fection； 5 and 6. Lysates of cells containing pSfV-prM RNAs at 48 h post-tran sfection；7. Lysates of cells containing pSfV-prM RNAs at 24 h post-transfecti on
4.表达的prM蛋白的特异性鉴定：对pSfV-prM重组RNA转染的BHK细胞 中表达蛋白的特异性，用D2-43病毒株特异的多克隆腹水抗体进行了免疫荧光检测。从图6 B可以看出，在用重组的pSfV-prM RNA转染的BHK细胞中有登革2型病毒特异的荧光存在。转 染后24和48h的细胞胞浆中有典型的特异荧光颗粒，这与SFV病毒蛋白合成的部位是一致的 。转染后24h的细胞中表达的特异蛋白荧光检出率高于48和72h的细胞，这可能与细胞的 生长状态和分泌蛋白的时间有关。转染后24h的细胞生长良好，而48h的细胞已出现衰老 迹象。最佳特异荧光检测时间，以转染后约24h为宜。经免疫荧光检测证实，转染细胞中 存在特异的D2-43病毒蛋白。表明登革病毒prM基因与甲病毒载体重组RNA的构建是成功的。 该重组RNA的构建，为进一步探讨以甲病毒载体为基础的登革病毒特异基因及其编码蛋白介 导的抗病毒作用的研究奠定了基础。
图6 在pSfV-prM重组RNA转染的BHK细胞中登革病毒特异蛋白的免疫荧光分析
Fig 6. Immunofluoresence analysis of a specific viral protein expressed in BHK c ells transfected with pSfV-prM RNA
At 24 h post-transfection, BHK cells were reacted with the polyclonal antibody of Dengue 2 virus
A. Cells were transfected with pSfV-LacZ RNA
B. Cells were transfected with a recombinant pSfV-prM RNA
基金项目：国家自然科学基金资助项目（39770036 ）
参考文献
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(收稿日期：1999-04-21)