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转染双启动子杆状病毒表达载体在昆虫细胞共表达人白细胞介素12
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第6期第20卷 细胞因子
作者：魏海明 田志刚 冯进波 徐彤 夏菁 孙
单位：山东省医学科学院基础医学研究所，山东肿瘤生物治疗研究中心)
关键词：白细胞介素12；表达；杆状病毒转染载体
【 摘要 】 目的 通过体外表达rhIL-12，以供研究其在体内外的生物学效应。方法 外周血单个核细胞(PBMC)、粘附细胞和人口腔表皮样癌细胞KB分别经SAC(含A蛋白的金黄色葡萄球菌CowanⅠ菌株)、IFN-γ＋LPS和PDBu(12，13-二丁酸佛波酯)刺激，以GIT(异硫氰酸胍)一步法提取细胞总RNA，经RT-PCR技术获取IL-12 P40和P35 cDNA，将两条基因分别插入双启动子杆状病毒转染载体pAcUW51的多角子启动子和P10启动子下游，构建真核表达载体pAcUW51/IL-12，与AcNPV共转染昆虫细胞Sf9，获取表达IL-12的细胞株，表达产物分别经SDS-PAGE，Western blot，ELISA和生物学活性鉴定。结果 rhIL-12产物的相对分子质量(Mr)经SDS-PAGE和Western blot鉴定为67×103，表达水平为15.4～15.7μg/106细胞。MTT法检测IL-12表达产物促进NK细胞杀伤K562细胞的能力比对照可提高60%，刺激PHA激活的PBMC增殖的能力最高可达到58%。结论 成功构建了双启动子杆状病毒表达载体pAcUW51/IL-12，获得了共表达IL-12 P40和P35亚单位的昆虫细胞株。
Coexpression of human IL-12 in insect cells transfected by double promoter baculovirus expression vector
WEI Haiming, TIAN Zhigang, FENG Jinbo, et al.
(Shandong Cancer Biotherapy Center, Shandong Academy of Medical Sciences, Ji′nan 250062, P. R. China)
【 Abstract 】 Objective Interleukin 12 (IL-12) is a heterodimeric cytokine composed of two covalently linked chains, P40 and P35. It is necessary to express recombinant human IL-12 for studying the biological effects of this cytokine in vivo and in vitro.Methods Peripheral blood mononuclear cells (PBMC), adherent cells and KB cell line were treated with Staphylococcus aureus CowanⅠ strain (SAC), IFN-γ+LPS and PDBu, respectively. Total RNA was extracted from these cells by the guanidine isothiocyanate method. cDNA for both P40 and P35 subunits of IL-12 were cloned by RT-PCR. Double promoter eukaryotic expression vectors, pAcUW51/IL-12 containing IL-12 P35 and P40 cDNA, were constructed. The vectors were used to co-transfect the insect cells (Sf9) with linearized polyhedrosis virus genomic DNA. The cell clones expressed the rhIL-12 products were analyzed by SDS-PAGE, Western blot, ELISA and biological assays.Results The molecular weight of recombinant human IL-12 products is about 67kD on SDS-PAGE and Western blot in non-reducing conditions. The expression level of recombinant human IL-12 was about 15.4μg-15.7μg/106 cells. The biological activities identified by two biological assays showed that the expressed products increased the proliferation of human PHA-activated PBMC and also the human NK cell-mediated cytotoxicity.Conclusion Double promoter baculovirus expression vector pAcUW51/IL-12 was successfully constructed and both P40 and P35 subunits of IL-12 were correctly coexpressed in insect cells.
【 Subject words 】 Interleukin 12; Expression; Baculovirus expression vector
白细胞介素12(IL-12)主要是由抗原提呈细胞产生的一种异二聚体(P40和P35)细胞因子，能显著增强NK/LAK细胞的杀伤活性，促进特异性CTL细胞的应答能力，诱导T细胞和NK细胞大量分泌IFN-γ，启动TH0细胞向TH1细胞的发育，在抗肿瘤、艾滋病等多种疾病中将发挥重要作用〔1〕。我们用SAC、LPS、IFN-γ和PDBu等刺激剂作用于外周血单个核细胞或口腔表皮样癌细胞株KB，成功扩增出IL-12 P40和P35 cDNA，并插入双启子杆状病毒表达载体pAcUW51,转染昆虫细胞Sf9，获得高表达IL-12的细胞株，现将有关结果报告如下。
材料和方法
细胞株、菌株与载体：人口腔表皮样癌细胞株KB购自中科院上海细胞所，K562、Raji和Sf9细胞为本室保存。E.coli DH5α和含A蛋白金黄色葡萄球菌为本室保存菌株，双启动子杆状病毒转染载体pAcUW51购自PharMingen，含多角体启动子和P10启动子，可同时表达两条多肽链。
引物设计与合成：根据文献〔2〕设计6条引物P1～P6，序列及扩增片段见表1，P1/P2引入BamHⅠ酶切位点，P4/P5引入BclⅠ酶切位点，由美国Verginia大学医学院高斌博士提供。
表1 IL-12引物序列
Table 1. PCR primers of human IL-12
| Primer | Sequence | bp |
| P1 | GC GGATCC ATG TGT CAC CAG CAG | |
| P2 | AT GGATCC CTA ACT GCA GGG CAC | P1P2 for IL-12 P40(1003bp) |
| P3 | GGA TCC AGT GCC TGC CCA GCT | P3P2 for IL-12 P40(417bp) |
| P4 | AT TGATCA ATG TGT CCA GCG CGC AGC | |
| P5 | GC TGATCA TTA GGA AGC ATT CAG ATA | P4P5 for IL-12 P35(676bp) |
| P6 | GAA TTC GAC ACC TCT TTC ATA | P6P5 for IL-12 P35(351bp) |
主要试剂：限制性内切酶BglⅡ、BclⅠ、BamHI、EcoRⅠ、牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)、T4 DNA连接酶、MMLV逆转录酶等购自GIBCO公司，IFN-γ、LPS、PDBu(Phorbol-12，13-dibutyrate)等购自Sigma公司，TMF-FH昆虫细胞培养基购自PharMingen公司，IL-12 ELISA试剂盒购自R&D公司。
SAC的制备：含A蛋白金黄色葡萄球菌在LB斜面培养基上长成菌苔后，生理盐水洗出，甲醛固定，无菌生理盐水洗涤后，80℃ 1 h杀菌，沉淀用RPMI 1640配成2%浓度，应用终浓度为0.02%。
末梢血单个核细胞的分离与刺激：血站抗凝血经淋巴细胞分离液分离出单个核细胞(PBMC)，后者在塑料板中37℃ 1 h后，分离悬浮细胞(PBL)和粘附细胞2种，调细胞浓度1×106/ml。用SAC刺激时终浓度为0.02%，37℃作用24 h，用IFN-γ＋LPS刺激时，先用1 000U/ml IFN-γ预处理16 h，再加LPS 5ng/ml刺激4 h。
KB，Raji，K562细胞培养与刺激：3种细胞常规RPMI 1640培养后，调细胞浓度1×106/ml。加终浓度为100nmol/L的PDBu，37℃作用24 h。
总RNA提取和RT-PCR反应：收集上述细胞经GIT一步法提取总RNA，MMLV逆转录酶合成cDNA，以其为模板分别扩增P40和P35长链及短链，PCR反应体积为100μl，P40长链(1 003bp)扩增参数为94℃ 1 min、60℃ 1 min、72℃ 2 min，循环30次，其它片段为94℃ 1 min、58℃ 1 min、72℃ 1 min，循环35次，末次延长72℃ 7 min。
P40和P35 cDNA序列测定：由上海基康生物技术有限公司完成。
IL-12杆状病毒表达载体的构建：P40(1 003bp)cDNA和pAcUW51经BamHⅠ酶切、低溶点琼脂糖回收相应片段，T4 DNA连接酶连接，转化DH5α菌，提取质粒经PCR和EcoRⅠ酶切鉴定，获得的重组质粒命名为pAcUW51/P40。再插入P35 cDNA，分别用BglⅡ酶切pAcUW51/P40，BclⅠ酶切P35 cDNA，回收相应片段，T4 DNA连接酶连接，转化DH5α菌，提取质粒经PCR和EcoRⅠ酶切鉴定(图1)。
图1 pAcUW 51/IL-12重组载体的构建
Fig 1. Map of recombinant hIL-12 plasmid construction
pAcUW51/IL-12共转染Sf9细胞：按PharMingen公司使用说明书进行，并以空斑法筛选阳性细胞株。
IL-12表达产物的鉴定：筛选的阳性细胞株经RT-PCR鉴定基因表达，SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白产物，ELISA测定IL-12蛋白含量。
MTT法检测IL-12表达产物促进PBMC体外增殖能力：PBMC经PHA作用48 h后，分离淋巴母细胞，调节细胞浓度为106/ml，加入不同稀释度的IL-12表达产物再作用48 h，MTT法检测增殖活性。
MTT法检测IL-12表达产物促进NK细胞杀伤活性：外周血单个核细胞经不同稀释度IL-12表达产物作用18 h后，以MTT法检测其杀伤K562细胞的活性。
结果
1.IL-12 P40 cDNA的扩增：PBMC和粘附细胞经SAC或IFN-γ＋LPS刺激后能扩增出P40短片段(417bp)，未扩增出长片段(1 003bp)，PBC经上述作用后长、短片段均未扩增出，KB细胞经PDBu作用后扩增出P40长片段和短片段，Raji和K562未扩增出任何片段(图2)，其中1 003bp cDNA经测序与文献报道序列一致。
2.IL-12 P35 cDNA的扩增：PBMC和粘附细胞经SAC或IFN-γ＋LPS刺激后能扩增出P35短片段(351bp)，粘附细胞尚扩增出P35长片段(676bp)，PBL经上述刺激后未扩增出P35片段，KB细胞经PDBu刺激后扩增出P35长片段及短片段，Raji和K562细胞未扩增出任何片段(图3)，其中676bp cDNA经测序与文献报道结果一致。
图2 RT-PCR扩增hIL-12 P40 cDNA的凝胶电泳图
Fig 2. Gel electrophoresis of RT-PCR products of hIL-12 P40 cDNA
Line 1: 100bp marker; Line 2: PBMC+SAC; Line 3: PBL+SAC; Line 4: adherent cells+SAC; Line 5: PBMC+IFN-γ+LPS; Line 6: Raji+PDBu; Line 7: KB+PDBu
图3 RT-PCR扩增hIL-12 P35 cDNA的凝胶电泳图
Fig 3. Gel electrophoresis of RT-PCR products of hIL-12 P35 cDNA
Line 1: 100bp marker; Line 2: PBMC+SAC; Line 3: PBL+SAC; Line 4: adherent cells+SAC; Line 5: PBMC+IFN-γ+LPS; Line 6: Raji+PDBu; Line 7: KB+PDBu; Line 8: adherent cells+IFN-γ+LPS; Line 9: Raji+PDBu; Line 10: K562+PDBu 3.pAcUW51/P40的鉴定：pAcUW51/P40经PCR反应能扩增出1 003bp片段，经BamHⅠ酶切亦获得1 003bp片段，经EcoRⅠ酶切，正向连接出现5 643bp和1 100bp 2条带，反向连接出现6 083bp和585bp 2条带。
4.pAcUW51/IL-12的鉴定：在pAcUW51/P40的基础上，插入P35片段，经PCR反应获得676bp片段，经EcoRⅠ鉴定，正向连接出现5 000bp+1 786bp+60bp(电泳时不易出现)，反向连接为5 000bp+1 200bp+676bp 3条带。
5.IL-12表达产物的鉴定：经空斑法筛选出表达IL-12的阳性细胞株，PCR扩增确定有P40和P35基因表达。SDS-PAGE显示有相对分子质量(Mr)为67×103表达产物存在(图4)，Western blot证实其为rhIL-12，ELISA测定细胞中IL-12的含量为15.4μg～15.7μg/106细胞。
图4 重组hIL-12 cDNA共表达产物的SDS-PAGE分析
Fig 4. SDS-PAGE analysis of hIL-12 cDNA coexpression
Line 1: Sf9 cells; Line 2-5: Sf9 cells transfected pAcUW51/IL-12 from 1 to 4 days; Line 6: protein marker 6.MTT法检测IL-12表达产物促进NK细胞杀伤K562细胞的能力：当效靶比为10∶1、IL-12作1∶10 000稀释时NK细胞的杀伤活性比对照提高60%，当效靶比为100∶1、IL-12作1∶100、1∶1 000稀释时，NK细胞的杀伤活性比对照分别提高55%和25%。
7.MTT法检测rhIL-12刺激PBMC增殖活性：将rhIL-12依次作1∶102、1∶103、1∶104、1∶105稀释，PBMC的增殖活性依次为24%、48%、58%、21%。
讨论
在迄今为止所发现的细胞因子中，IL-12具有独特的结构特点，为两条多肽链通过二硫链共价结合的Mr为70×103(P70)二聚体，其重链(P40)由306个氨基酸组成，包含10个半胱氨酸残基和4个潜在的糖基化位点，轻链(P35)由197个氨基酸组成，包含7个半胱氨酸残基和3个潜在的糖基化位点。为了克隆和表达IL-12 P40和P35基因，我们通过SAC和IFN-γ＋LPS分别作用PBMC、PBL和粘附细胞，应用RT-PCR技术，参考已发表的IL-12 cDNA基因序列，设计相应引物，结果从PBMC和粘附细胞中扩增出IL-12的2条基因片段，经PDBu刺激的人KB细胞也扩增出2条基因片段，可能由于不同细胞IL-12 mRNA的丰度不同，仅在KB细胞和粘附细胞中扩增出编码IL-12全长氨基酸的cDNA P40和P35，在PBL、Raji、K562细胞中未扩增出IL-12基因片段。
由于IL-12由2条多肽链组成，且含有较多糖基化位点，体外表达较为困难。杆状病毒/昆虫细胞表达体系是真核表达体系中较为先进的一种，由于杆状病毒基因组可在昆虫细胞内复制和转录，其巨大的DNA(80～200kb)复制后组装在杆状的核衣壳内，后者具有较大的柔软性，能容纳大片段外源DNA，杆状病毒体内高表达多角体蛋白和P10蛋白，其启动子具有极强的启动蛋白表达能力，被用来构建杆状病毒转染质粒〔3〕，我们选用PharMingen公司最新构建的双启动子杆状病毒转染载体pAcUW51，该载体以杆状病毒AcNPV多角体启动子为构建基础再插入P10启动子，可同时表达2条多肽链。但2个启动子下游均没有多克隆位点，其中多角体启动子下游仅有BamHⅠ插入位点，P10启动子下游仅有EcoRⅠ和BglⅡ插入位点(见图1)，而P40 cDNA中含EcoRⅠ位点，P35基因中含EcoRⅠ、BamHⅠ和BglⅡ位点。这样P40 cDNA只能以BamHⅠ单酶切方式插入pAcUW51，经EcoRⅠ鉴定获取正向连接重组载体pAcUW51/P40后，再以BglⅡ切成线性，同时将P35 cDNA经BclⅠ酶切(BglⅡ和BclⅠ粘末端匹配)，从而将P35 cDNA插入pAcUW51/P40，构建成功pAcUW51/IL-12重组载体，将该重组载体与Baculo GoldTMDNA共转染Sf9昆虫细胞获取了IL-12真核表达产物，经PCR、ELISA、SDS-PAGE、Western blot等方法鉴定后，证实表达产物为rhIL-12，Mr为67×103，但SDS-PAGE显示67×103为主带，未见明显P35和P40带型，估计完整蛋白未完全解开，与D′Anerea用CHO表达的产物相似〔4〕，其中原因有待进一步分析。进一步研究发现，该表达产物对NK细胞杀伤K562细胞有较强的促进作用，体外对PBMC也有较强的促进增殖能力，该表达产物的获取，为IL-12的免疫调控和抗肿瘤研究工作奠定了基础。
基金项目：山东省科委科技攻关基金资助项目(96314916)
参考文献
1，Lamont AG, Adorini L. IL-12: A key cytokine in immune regulation. Immunology Today, 1996, 17(5):214-217.
2，Wolf SF, Temple PA, Kobayashi M, et al. Cloning of cDNA for natural killer cell stimulatory factor, a herterodimeric cytokine with multiple biologic effects on T and natural killer cells. J Immunol, 1991, 146(9):3074-3081.
3，魏海明, 田志刚. 重组杆状病毒/昆虫细胞表达体系在肿瘤研究中的应用.国外医学肿瘤学分册, 1997, 20(6):283-287.
4，D′Andrea A, Rengaraju M, Valiante NM, et al. Production of natural killer cell stimulatory factor (Interleukin 12) by peripheral blood mononuclear cells. J Exp Med, 1992, 176:1387-1398.
(收稿日期：1999-07-12)