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Detection of rotavirus RNA using DIG labelled probe prepared by polymerase chain reaction
Fu Wanhai, Hao Wei, Peng Yijun. Department of Pediatrics of Zhujiang Hospital. First Military University, Guangzhou 510282
Abstract The digoxigenin (DIG) labelled cDNA probe of rotaviruse was directly prepared by polymerase chain reaction(PCR). The results of cDNA-RNA hybridizaton showed that the DIG-cDNA probe exhibits rotavirus specificity and can detect as tiny as 10pg rotavirus RNA. 120 fecal samples of diarrhea from infants and young children were tested by dot-blot hybridization. It was shown that the positive rate of dot-blot hybridization(65.0%)was significantly higher than that of PAGE(49.1%). This study indicated that direct preparation of DIG-labelled rotavirus-cDNA probe by PCR is much faster and simpler than common method of labeling.
Key words: Rotavirus Polymerase chain reaction Digoxigenin labeling Dot blot hybridization
人类轮状病毒(HRV)是引起婴幼儿秋冬季腹泻的主要病原。迄今为止，分子杂交技术检测婴幼儿粪便中轮状病毒是最敏感的方法之一〔1，2〕。但常规使用的同位素标记探针因半衰期短，具有放射性，要求一定的仪器设备，在一定程度上限制了其应用和对临床的指导价值。我们用聚合酶链反应(PCR)技术制备地高辛素HRV cDNA探针，检测婴幼儿腹泻粪样标本，并同聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术进行比较。
1 材料和方法
1.1 标本采集及处理 系1991年10月至1993年1月采集的住院婴幼儿腹泻粪便标本。用无菌棉签取新鲜粪便2～4g，装入高压灭菌后的青霉素小瓶中，用10mmol/L(pH7.4)PBS按1∶4(W/V)稀释，-20℃保存。成人轮状病毒(ADRV)感染的粪便由本校流行病学教研室余守义教授惠赠。
1.2 HRV标准株的来源及培养 Wa株(血清型Ⅰ)，S2(血清型Ⅱ)，SAll株(血清型Ⅲ)，HO-chi株(血清型Ⅳ)，NCDV(血清型Ⅵ)均由中山医科大学微生物教研室提供。该病毒株用含胰酶的营养液，在MA 104细胞上旋转培养，待细胞病变达75%或以上时收获，置-20℃保存待用。
1.3 各种酶类 AMV逆转录酶(Reverse transcriptase)为美国Promega公司产品；FD-DNA聚合酶为上海复旦大学产品。
1.4 地高辛素标记及检测试剂盒 德国Boehringer Mannheim公司产品。
1.5 PCR引物及来源 取自A组HRV VP7第9基因片段两个高度保守区序列。PⅠ为51-71碱基区段，PⅡ为376-392碱基区段，由上海细胞所合成。
1.6 HRV cDNA的制备 标准株的细胞培养上清或粪样标本上清用酚和氯仿/异戊醇(24∶1)方法提取HRV RNA。取RNA混悬液5μl(经95℃变性7min)，负链特异性引物PⅡ25pmol/L,MgCl28mmol/L,KCl 50mmol/L,核糖核酸酶抑制素0.5U，AMV逆转录酶8U，混匀，42℃温育45min，冰浴3min。
1.7 PCR方法标记HRV地高辛素探针 取HRV Wa株cDNA为模板，地高辛Labeling mixture2μl，5×buffer 10μl,pⅠ、pⅡ各1μl，补足双蒸水至50μl，同时取5μlWa株cDNA作为对照，不加地高辛Labeling Mixture,按本实验室方法进行PCR扩增（3）。
1.8 PAGE 采用垂直板型不连续电泳，浓缩胶为3%(pH6.8)，分离胶为10%(pH8.8)，用20mA/板电泳4～5小时，按Herring银染色法进行染色显影。
1.9 斑点杂交 ①点膜：将待检HRV RNA20μl经煮沸10min变性点样于20×SSC预处理的NC膜上，室温下晾干，经碱变性中和处理，室温下晾干NC膜，置80℃烘干2小时。②杂交：将NC膜与预杂交液(5×SSC，0.1%Sarcosyl, 0.02%SDS,1%Blocking reagent),密封于杂交袋中，68℃预杂交2小时，倒净预杂交液，加入杂交液(5×SSC，0.1%Sarcosyl,0.02%SDS,5.0%Blocking reagent),预先加热变性的HRV cDNA地高辛素探针2μl，68℃杂交8小时或过夜完成杂交。③免疫测定：分别用100ml洗液Ⅰ(5×SSC,0.1%SDS)和洗液Ⅱ(0.1×SSC， 0.1%SDS)，洗膜2次。1%Blocking reagent阻断30min，加入碱性磷酸酶交联的抗地高辛抗体Fab片段孵育30min后，洗涤，平衡，NBT显色(NBT45μl，BCIP35μl,1×碱性磷酸酶缓冲液10ml)3～4小时，出现蓝色斑点为阳性。
1.10 特异性和敏感性实验 取Wa,S2，SAll，HO-chi,NCDV, ADRV株的RNA，和人类巨细胞病毒(HCMV)株的DAN，煮沸10min变性后点膜，杂交。取HRV Wa 株RNA定量后稀释为100ng,10ng,1ng,100pg,10pg,1pg变性后点膜。
2 结果
2.1 HRV cDNA地高辛素探针的标记结果 PCR方法标记的地高辛素探针产物与对照产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳约30分钟，紫外灯下观察结果，未加地高辛-11-dUTP的产物与分子量标准pBR322DNA/HinfⅠ比较约为342bp,而加入地高辛-11-dUTP的PCR产物，由于所扩增的基因片段中掺入了地高辛-11-dUTP，故分子量较大，在电泳中泳动较慢，与分子量标准比较约为390bp(见图1)，说明探针标记成功。
2.2 斑点杂交结果 地高辛素标记的HRV/VP7cDNA探针与120份婴幼儿腹泻粪样标本杂交，在严格杂交条件下(68℃)杂交6小时，其中有78份阳性(65.0℃)。
2.3 PAGE检测结果 120份婴幼儿腹泻粪样标本，经PAGE检查阳性者59份(49.17%)，电泳图谱皆为长型图谱(4∶2∶3∶2)。
表1 两种方法对婴幼儿粪样标本HRV的检测结果
Tab.1 Detection of HRV in fecal specimens from infants and childern with diarrhea by two different methods
| PAGE | Dot blot | 合计
Total | |
| + | - | ||
| + | 56 | 3 |
59 |
| - | 22 | 39 | 61 |
| 合计
Total |
78 | 42 | 120 |
图1 PCR方法标记HRV cDNA地高辛素探针的琼脂糖凝胶电泳
fig. 1 Agarose gel electrophoresis pattern of digoxigenin labelled HRV cDNA probe by PCR
1:DNA marker of pBR 322/Hinf Ⅰ. 2,4:PCR product labelled with DIG. 3,5: PCR product not labelled with DIG
图2 PCR产物标记DIG探针与RV RNA杂交的结果
fig. 2 Dot blot hybridization of PCR product labelling DIG probes with RV RNA
1 to 7 were Wa, S2, SAll, HO-chi, NCDV, ADRV,HCMV strains, respectively
图3 DIG探针的敏感性检测
fig. 3 Sensitivity test of DIG probes
1 to 6:RNA diluted as 100ng, 10ng, 1ng, 100pg, 10pg, 1pg
2.4 斑点杂交与PAGE结果比较 在120份粪便标本中，两者均阳性56份，均阴性39份，总符合率为79.17%(96/120)。PAGE法阳性的59份中有3份斑点法为阴性，而PAGE法阴性的61份中，斑点法又检出22份(36.07%)HRV rNA(见表1)。
2.5 特异性与敏感性比较 在同一张NC膜上，A组HRV(Wa,S2，SAll,HO-chi, nCDV)均有杂交信号，ADRV与HCMV未显示阳性结果(见图2)。该探针与定量倍比稀释的Wa株RNA(100ng,10ng,1ng,100pg,10pg,1pg)杂交，在RNA为10pg时仍有杂交信号(见图3)。3 讨论
地高辛素是从植物洋地黄中提取的固醇类半抗原物质，借嘧啶环5位上的一个间臂与dUTP相连接成DIG-11-dUTP，在PCR扩增时作为dUTP结构类似物，掺入到DNA链中（4）。由于掺入DIG-11-dUTP,其分子量比不含有DIG-11-dUTP的扩增产物大，故电泳时迁移速度相对缓慢。
随着分子生物学技术的不断发展，采用PCR技术制备32P、地高辛素标记探针，国内外已见报道（5～7），我们采用PCR技术扩增HRV Wa株的VP7基因51-392碱基区段制备HRV VP7地高辛素探针。实验证明，PCR技术制备探针具有操作简便，快速，标记率高，且特异性好。我们认为，在具备特异性引物的条件下，PCR方法标记探针值得推荐。
1996年10月3日收稿 1997年9月11日修回
参 考 文 献
1 Flores J, Sears J, Schael I P, et al. Identification of human rotavirus serotype by hybridization to polymerase chain reaction generated probes derived from a hyperdivergent region of the gene encoding outer capsid protein VP7. J Virol, 1990,64(8):4021.
2 Joseph J E, Firoozmand F, Sato S, et al. Detection of group B rotavirus in fecal specimens by dot hybridization with a cloned cDNA probe. J Clin Microbiol, 1989,27(3):422.
3 傅万海，彭宜君，卓礼梅等.聚合酶链反应诊断新生儿轮状病毒无症状感染的研究.中华微生物学和免疫学杂志，1994，14：54.
4 刘妙良.地戈辛配基标记核酸技术及其应用.生物化学及生物物理进展，1992，19：34.
5 Lanzillo JJ. Preparation of digoxigenin labelled probes by the polymerase chain reaction. Biotechniques, 1990,8(6):621.
6 Lion T, Haas OA. Nonradioactive labelling of probe with digoxigenin by polymerase chain reaction. Anal Biochem, 1990,188:335.
7 周荣，梁炽森，骆康先等.应用聚合酶链反应制备高比放32P-HBV DNA探针.中华实验和临床病毒学杂志，1991，5(3)：344.