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Gene cloning, expression and immunological identification of a single chain antibody fragment 3D3 against Dengue type 3 virus Si Bingyin, Yang Peiying, Qin Ede, et al. Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military Medical Scienes, Beijing 100850
Abstract Hybridoma 3D3 which secreted monoclonal antibody against Dengue type 3 virus was used to extract mRNA and then was reverse-transcripted into cDNA for amplifying heavy and light chain variable domain genes. The amplified lihgt and heavy chain variable domain genes were connected by flexible linker to form a single chain antilody fragment (ScFv) gene of 750bp, which was cloned into phage pCANTAB5 vector using the recombinant phage antibody system. The ScFv gene was expressed as fusion protein with phage g3p coat protein and displayed on the phage surface. The phagemid was used to transform competent E.coli TG1 cells and then infected with M13K07 helper phage to rescue the phagemid and antibody ScFv gene.12 of the 20 randomized clones were shown to react with dengue type 3 virus by immunofluorescence.
Key words: Dengue virus Antibody fragment,single chain Cloning Expression Polymerase chain reaction
自从1975年杂交瘤技术问世以来，单克隆抗体作为诊断试剂，在疾病的诊断中已得到了广泛的应用。但是在疾病的治疗方面，由于人源化抗体制备技术目前尚不完善，临床上使用的单克隆抗体大都是鼠源性的，后者容易引起抗鼠抗体，对鼠单抗产生排斥反应，因此限制了它的临床应用。为了克服鼠源性单抗这一缺陷及人源性单抗制备上的因难，人们试图通过生物工程的方法来解决这一难题，相继产生了人/鼠嵌合抗体〔1〕、人源化抗体〔2〕和单链抗体〔3，4〕以解决单克隆抗体在治疗中存在的免疫反应问题。单链抗体(Single chain antibody fragment,ScFv)是目前人们研究最活跃的领域之一，它是由连接肽把重链可变区(HV)和轻链可变区(LV)连接而产生的，这种抗体由于仅含有抗体分子的重链和轻链可变区和一段由十几个氨基酸组成的多肽，其分子量小，不含有抗体的Fc片段，不被细胞结合，在体内不易产生排斥反应，因此作为一种治疗制剂在临床上比完整抗体具有更多的优越性。为此我们选用抗登革3型病毒与登革1、2、4型病毒在免疫荧光和血凝抑制有交叉反应的单克隆抗体3D3的单链抗体进行了研究。
1 材料和方法
1.1 杂交瘤细胞的培养及鉴定 抗登革3型病毒的单克隆抗体3D3经中和试验证明具有中和登革3、1、2、4型病毒和部分黄病毒的活性〔5〕，经IgG亚类鉴定是IgG1，杂交细胞在含有10%牛血清的1640 RPMI培养基上培养。
1.2 杂交瘤细胞mRMA的提取 用Promega公司的总RNA提取试剂盒提取总RNA。然后用Promega公司mRNA提取试剂盒从总RNA中提取mRNA,方法见说明书。
1.3 cDNA的合成及轻、重链可变区基因PCR扩增 按照Pharmacia公司的重组噬菌体系统试剂盒说明书操作，以纯化的mRNA为模板，以随机六寡聚核苷酸为引物，在反转录酶的催化下合成第一链cDNA,以cDNA为模板，在50μl的反应体系中分别加入轻、重链可变区引物，2.5U的TaqDNA聚合酶(Promega公司)进行PCR扩增。条件是：94℃1分钟，55℃退火2分钟，72℃延伸2分钟，共进行35个循环，最后一个循环后72℃再延伸10分钟。分别从轻、重链可变区PCR扩增产物中取3μl在 1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，其余部分用MicrospinTM柱分别对轻、重链进行纯化。重链Marker和ScFv Marker均来自pharmacia试剂盒。
1.4 ScFv基因的组装及PCR扩增 纯化的HV和LV基因片段与连接引物在等摩尔浓度的条件下，在25μl的反应体积中，加入2.5mmol/L dNTP和2.5U的TaqDNA聚合酶，进行7次退火反应组装成ScFv，每次退火反应的条件是94℃变性1分钟，55℃退火4分钟。然后以ScFv基因片断为模板，在上述反应体系中加入一对在ScFv的5’含有SfiⅠ，在3’含有NotⅠ的双酶切位点的引物，进行PCR循环：94℃变性1分钟，55℃退火2分钟，72℃延伸2分钟，最后一次循环在72℃保温10分钟。
1.5 ScFv基因片段的克隆与表达 扩增好的ScFv片段经Sephacryl-400柱纯化后，用SfiⅠ和NotⅠ双酶切，然后将双酶切好的ScFv片段与载体pCANTAB5质粒连接转化大肠杆菌TG1感受态细胞，在氨苄青霉素选择性培养基上筛选转化菌落，用2×YT-AG培养基(2×YT含有100μl/ml氨苄青霉素和2%葡萄糖)从选择培养基收集全部转化的菌落并将其细胞悬液稀释至A600处的吸收值约0.3～0.4左右，培养至对数生长期，取3.2ml细胞悬液加入11.6×109PFU M13 K07噬菌体于37培养1小时，将细胞离心重悬于20ml不含葡萄糖、含有100μl/ml氨苄青霉素50μl/ml的卡哪霉素的2×YT培养基上，37℃培养过夜，离心收集含有重组噬菌体的上清。
1.6 登革病毒抗原的制备 在一个细胞瓶内待C6/36细胞单层后感染登革3型病毒，等细胞病变+～++后去除细胞培养液，用PBS洗1次，等细胞干后用冷丙酮在-20℃固定1小时，去除丙酮后放-20℃备用。
1.7 登革病毒抗原片的制备 C6/36细胞成单层后感染登革3型病毒，待细胞病变一个+后，用适量的细胞培养液悬浮细胞，将其滴到镀膜的玻片上，放37℃ CO2孵箱培养8～12小时，然后用PBS洗玻片去除未贴壁的细胞，等细胞干后用冰冷的丙酮在-20℃固定30分钟，取出后放-20℃备用。
1.8 免疫亲合法筛选重组噬菌体 含有重组噬菌体的上清液5ml与丙酮固定的登革病毒抗原在37℃保温1.5小时，用PBS(含有0.5%Tween-20)在振荡器上洗6次，每次振荡5分钟，去除未与登革3型病毒抗原特异性结合的重组噬菌体。加5ml的对数生长期的TG1细胞，在37℃保温1小时，然后将感染细胞涂在含有100μg/ml氨苄青霉素固体培养上，30℃培养过夜，从固体培养基上随机挑选20个单个菌落，分别在200μl 2×YT-AG培养基上30℃培养过夜，次日用M13K07噬菌体分别感染转化的细胞，将感染的细胞转移到含有氨苄青霉素和卡哪霉素的2×YT培养基中37℃培养过夜，次日离心，上清液含有抗体表达的噬菌体作免疫荧光。
1.9 免疫荧光鉴定阳性克隆 在登革3型病毒感染的C6/36细胞抗原片上加10μl表达的噬菌体样品，37℃保温40分钟，洗涤去除未与登革病毒抗原结合的噬菌体，加10μl兔抗M13噬菌体抗体，37℃保温40分钟，洗涤，然后加10μl 1：16稀释的羊抗兔荧光素标记的IgG，37℃保温40分钟，洗涤，观测结果。
2 结果
2.1 3D3单抗HV和LV基因片段的扩增及鉴定 结果见图1。
2.2 抗体可变区的基因拼接和PCR扩增 回收的HV和LV片段与连接引物(93个核苷酸)在等摩尔浓度下经7次退火循环组装成单链可变区基因片段(ScFv)，以ScFv为模板加入一对在5’含有SfiⅠ、在3’含NotⅠ酶切位点引物，进行PCR扩增35个循环，扩增产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳，结果见图2，可见ScFv片段的大小与ScFv Marker相一致约750bp，PCR产物经SfiⅠ和NotⅠ双酶切纯化后，得到带有酶切位点的ScFv片段。
图 1 LV和HV基因PCR扩增产物的鉴定
Fig.1 Identification of the PCR products of the HV and LV
1: LV PCR product; 2:Standard HV marker; 3: HV PCR product
图 2 ScFv基因组装，扩增产物PCR鉴定结果
Fig.2 Identification of assembly and amplification of ScFv gene by PCR
1: 750bp ScFv PCR product;2: ScFv marker of 750bp DNA
2.3 ScFv基因的克隆与表达 将纯化的带有酶切位点的ScFv基因克隆到噬菌体载体pCANTAB5上，然后转化感受态大肠杆菌TG1，用选择性固体培养基筛选转化菌，从选择培养基上收集全部转化的菌落，用M13K07噬菌体感染转化菌，在含葡萄糖、氨苄和卡那霉素的2-YT培养基进行筛选重组噬菌体。由于M13K07噬菌体的携带抗卡那霉素基因并能拯救噬菌体蛋白的表达和组装，因此只有感染M13K07噬菌体的细菌才能在卡那霉素培养基上生长并使单链抗体表达在噬菌体表面。
2.4 具有免疫活性重组噬菌体的筛选 把重组噬菌体与登革3型病毒抗原在37℃保温后，用含有0.5% Tween-20的PBS在振荡器充分洗涤以去除未与登革3型病毒抗原结合的噬菌体(表达阴性的噬菌体)，这样通过表达在噬菌体表面的单链抗体能与登革3型病毒抗原特异性结合的特性筛选出阳性克隆，然后用能与登革3型病毒抗原结合的噬菌体感染TG1细胞，接种到氨苄选择性培养基上随机挑选20个克隆，其中1号克隆经培养后用碱法提取pCANTAB5-ScFv重组质粒，用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切，其酶解产物用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。如果ScFv基因没有插到pCANTAB5E载体上可产生3条带，分别为3170bp，607bp和102bp的片段，如果ScFv基因插到pCANTAB5E载体上可产生3条分别约为3170bp，607bp和850bp的片段。从图3上可以看出3条带分别约为3200pb，850pb和600pb。其中850pb的片段含有ScFv基因，说明ScFv基因插到载体上了。
2.5 表达产物的鉴定 重组噬菌体上清液用丙酮固定的登革病毒感染的C6/36抗原片，兔抗M13噬菌体抗体和荧光素标记羊抗兔IgG进行免疫荧光鉴定，结果表明，20个克隆有12个克隆能与登革3型病毒抗原发生特异性的结合，其中6、9、20号克隆免疫荧光最强(图4)，从图中(9号克隆)的结果可以看出，重组噬菌体抗体与登革3型病毒抗原的结合发生在细胞质内，与登革病毒在细胞质内复制和与原单克隆抗体3D3与登革3型病毒抗原结合发生在细胞质内是一致的，说明重组噬菌体抗体与登革3型病毒抗原结合是特异性的。
图 3 重组质粒1号用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切
Fig. 3 Identification of recombinant plasmid digested with Hind Ⅲ and BamH Ⅰ
1: Recombinant plasmid digested with Hind Ⅲ and BamH Ⅰ. 2:Recombinant plasmid digested with Hind Ⅲ. 3:λDNA/Hind Ⅲ marker
图 4 用登革3型病毒感染的C6/36细胞抗原检测噬菌体表达的ScFv间接免疫荧光结果(9号质粒)
Fig.4 Indirect immunofluorescence of phage expressed ScFv on Dengue type 3 virus infected C6/36 cells
3 讨论
我们利用Pharmacia公司最近推出的重组噬菌体抗体系统试剂盒，对抗登革3型病毒单克隆抗体3D3的单链抗体进行构建，克隆及表达，通过免疫荧光对表达产物的分析，结果表明噬菌体-单链抗体保留了亲代抗体的特性，能与登革3型病毒抗原发生特异性的结合，这一研究结果为抗登革3型病毒抗体在登革病毒的诊断和治疗的应用奠定了基础。
目前常用来获得抗体可变区基因的方法大多从mRNA反转录为cDNA，然后再进行PCR［6］或由基因组中直接PCR［7］获得。我们采用Pharacia公司的试剂盒，从mRNA反转录为cDNA，然后加入两组混合引物分别对轻、重链可变区基因进行PCR扩增。由于是混合引物对某些杂交瘤细胞可能产生一条异常的轻链和重链，按照试剂盒试剂说明书属于正常现象，我们在轻、重链可变区基因的扩增中在轻链出现了一条异常的带，由于它的分子量远远大于轻链，所以我们在轻链的回收中仅回收了轻链带，如果两条带分子量相近可以把两条带都回收，使其与重链连接引物一起连接，可以在噬菌体抗体筛选过程中由于抗体表达异常的噬菌体不能与抗原发生特异性的结合而被筛掉。
参 考 文 献
1 Sharon J, Gefer M L, Morrison S L, et al. Expression of a chimaeric protein in mouse myeloma cells. Nature, 1984, 309:364-367.
2 Boulianne, Hozumi N, Shulwan M J, et al. Production of functional chimaeric mouse/human antibody. Nature, 1984, 312:643-646.
3 Jilliffe L K.Humanized antibodies. Enhancing therapeutic utility through antibody engineering. Int Rev Immunol, 1993, 10:241-250.
4 Jiang W R, Bonnert T P, Karunakarannair V, et al. A single chain antibody fragment expressed in bacteria neutralizes tick-borne, flaviviruses. Virology, 1994, 200:21-28.
5 祝庆余，陈云亮，辛颜彬，等.用单克隆抗体分析鉴定登革3型病毒的不同抗原决定簇.军事医学科学院院刊，1985， 4：407-410.
6 Orlandi R, Gussow D H, Jones P T, et al. Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86:3833-3837.
7 Ward E S, Gussow D H, Griffiths A D, et al. Binding activities of repertoire of single immunogobulin variable domain secreted from E.coli. Nature, 1989, 341(12):544-546.