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Cloning, sequencing and expressinon of Hepatitis E virus structural gene in E. coli and application of the recombinant products for diagnosis Rong Guangya,Sun Jie,Zhou Jiwen,et al.Center for Diagnostic Reagents,The 302 Hospital of PLA,Beijing 100039
Abstract The prokaryotic expression vector PEGX-3X was used to express hepatitis E virus (HEV) open reading frame 2(ORF2 402-660).The recombinant protein was soluble in PBS buffer and was purified by the glutathione Sepharose 4B affinity column.When the purified recombinant protein was applied to detect HEV antibodies in sera of clinical patients,the results were quite consistent with the HEV diagnostic kit from Diagnostic Biotechnology Ltd(DBL),Singapore.The recombinant protein was more reactive with HEV antibodies than DBL reagent.
Key words: Hepatitis E virus Gene Expression
戊型肝炎病毒(HEV)经胃肠道传播，在我国新疆地区曾爆发流行，全国各地均有散发病例。为了解决病毒诊断问题，我们曾以合成肽作抗原建立了戊型肝炎病毒抗体(抗-HEV)酶联免疫方法〔1〕，该方法和新加坡DBL公司抗-HEV试剂盒对比，灵敏度稍低。为了进一步提高诊断HEV感染的敏感性，我们利用基因重组技术表达了HEV ORF-2主要免疫表位区域，并对重组抗原的免疫原性进行了初步分析。
1 材料和方法
1.1 质粒和菌株 表达质粒pGEX-3X及大肠杆菌JM105为Pharmacia公司产品。
1.2 酶与试剂 Taq酶，逆转录酶AMV-RT，核酸酶抑制物rRNAsin，限制性内切酶ECORI，BamHI，SmaI。dNTP，PCR产物纯化试剂盒均为美国Promega公司产品；Suredone连接盒及谷胱甘肽Sepharose-4B柱为瑞典Pharmacia公司产品。戊型肝炎抗体阳性血清来源于302医院住院患者。
1.3 HEV-RNA的提取，cDNA的合成以聚合酶链反应 HEV-RNA采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法〔2〕，从感染戊型肝炎病毒猴胆汁中提取。套式聚合酶链反应(RT-PCR)参照文献〔2〕。第1次PCR 40次循环，第2次PCR 30次循环，循环参数为95℃1min，45℃1min，72℃1min。
1.4 PCR扩增产物纯化及测序 PCR产物用PCR产物纯化试剂盒纯化。纯化模板由赛白盛(美国)生物工程公司DNA序列分析仪测定序列。
1.5 重组质粒的构建及鉴定 质粒提取、纯化、酶切、连接、转化及克隆筛选参照文献〔3〕，或按Sureclone连接盒说明书操作。用快速碱裂解法提取质粒DNA，经酶切分析筛选鉴定。阳性克隆再经序列分析证实。
1.6 HEV ORF2蛋白的诱导表达及活性鉴定 含有HEV ORF2基因重组质粒的细菌，在含有氨苄青霉素的LB培养基中37℃振摇培养至对数生长期，加IPTG至终浓度100mmol／L，诱导4小时，离心收集菌体，超声裂解后加Triton-X100至终浓度1%，再次离心，收集上清，加样品缓冲液煮沸3min后进行SDS-PAGE电泳。EIA应用间接法，重组抗原粗品用谷胱甘肽Sepharose-4B亲合层析柱纯化，获得表达产物纯品。用不同稀释度的重组抗原室温包被Nunc板。封闭后加入待检血清37℃温育30min，再加辣根过氧化物酶标记的抗入IgG，加入TMB酶底物显色，在450nm波长测定吸光度A值。
1.7 引物设计与合成 引物设计参照HEV缅甸株〔4〕及中国新疆株〔5〕序列。引物合成及纯化均由我们自己完成。应用计算机PCR引物设计软件辅助设计。引物的序列及位置如下：E1，6326-6345，+，5'-CAGCTGTTCTACTCTCGCCC-3'，E7，6350-6369，+，5'-GTCTCAGCCAATGGCGAGCC-3'，E3，7144-7123，-，5'-GCACAAGCAAATAAACTATAAC-3'。
2 结果
2.1 HEV ORF2基因片段的扩增 提纯的HEV RNA经逆转录，首先用E1和E3引物对进行第1次PCR，再用E7E3引物对进行第2次PCR。第二次扩增获得的DNA片段与理论预计的HEV ORF2基因片段795bp大小一致(图1)，序列分析证实为HEV ORF2基因片段。
2.2 表达质粒的构建 经RT-PCR扩增的HEV ORF2的基因片段，用PCR产物纯化柱纯化，经Klenow片段反应去除PCR末端突出的A碱基，再经T4多核苷酸激酶磷酸化后，插入经SmaI酶切和碱性磷酸酶去磷酸化的载体pGEX-3X中，转化大肠杆菌JM05，挑选正向连接阳性克隆，命名为HEV 9607。HEV 9607菌株质粒经BamHI及EcoR Ⅰ酶切鉴定，电泳结果可见和PCR扩增产物相应的基因片段(图1)序列测定结果(图2)，HEV 9607和HEV缅甸株及中国新疆株比较，核苷酸同源性分别为93.58%和98.87%，氨基酸同源性分别为98.45%和98.84%。
图 1 重组质粒的酶切鉴定
Fig.1 Identification of positive clone digested
with restriction enzymes
M:DNA marker. 1：PCR product(795bp).
2:HEV 9607/Bam HI+EcoRI
2.3 诱导和SDS-PAGE 将HEV 9607菌落和只含有pGEX-3X空质粒的细菌，分别接种于2ml LB-Ampicilin培养液，37℃培养过夜，接种于50ml新鲜LB-Ampicilin培养液，37℃培养4小时后，用IPTG诱导4小时，离心收集菌体。部分表达产物经谷胱甘肽Sepharose-4B柱纯化，粗品及纯品进行SDS-PAGE。只含有pGEX-3X空质粒的细菌在电泳图上显示出单纯的GST蛋白带(26kD)，HEV 9607菌落不再含有单纯的GST蛋白带，而较对照多出一条其分子量约为56kD的蛋白带，与标准的融合蛋白分子量一致，见图3。
2.4 表达产物的抗原活性及初步应用 为检测表达产物的抗原活性并探索其应用的价值，用谷胱甘肽Sepharose-4B柱纯化的表达蛋白和单纯的GST蛋白分别包被酶联板，检测经新
2 戊型肝炎病毒克隆核苷酸序列
B行为缅甸株HEV的核苷酸序列；C行为中国新疆株HEV的核苷酸序列
Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequencs of HEV cDNA(9607)
Line B represents the sequence of Burma isolate. Line C represents the sequence of Chinese isolate
图 3 表达产物的SDS-PAGE电泳分析
Fig. 3 SDS-PAGE of expressed product
1:MW marker. 2:PGEX(raw). 3:PGEX(pure).
4:HEV 9607(raw). 5:HEV 9607(pure)
加坡DBL公司戊肝抗体试剂盒及我们以前建立的合成肽戊肝抗体试剂盒反复检测过的10份戊肝抗体阳性血清及阴性血清，10份阳性血清为国外试剂检测弱阳性及中度阳性血清，用合成肽试剂检测反应较弱或无反应的标本。结果见表1。另外，我们用基因重组抗原包被的微孔板检测了50份急性非甲非乙非丙肝炎患者血清，结果阳性率为42%，和新加坡DBL公司试剂检测结果一致。
表 1 EIA检测结果
Tab.1 Result of EIA
| No. | DBL | SP | HEVORF-2 |
| 阴性样品
Negative samples | |||
| L49 | 0.052 | 0.076 | 0.018 |
| M16 | 0.016 | 0.092 | 0.014 |
| M56 | 0.049 | 0.058 | 0.025 |
| M68 | 0.009 | 0.058 | 0.026 |
| M72 | 0.005 | 0.036 | 0.014 |
| N52 | 0.020 | 0.094 | 0.013 |
| N72 | 0.020 | 0.034 | 0.021 |
| O13 | 0.019 | 0.072 | 0.013 |
| O20 | 0.004 | 0.059 | 0.014 |
| O22 | 0.009 | 0.075 | 0.008 |
| 阳性样品
Positive samples | |||
| L24 | 1.226 | 0.453 | over |
| M2 | 1.571 | 0.753 | 2.214 |
| M5 | 1.386 | 0.624 | 1.389 |
| N29 | 0.968 | 0.262 | over |
| N50 | 0.568 | 0.532 | 1.912 |
| Q63 | 0.513 | 0.451 | over |
| S100 | 1.545 | 0.940 | 1.890 |
| U52 | 1.890 | 0.506 | 2.364 |
| V13 | 1.110 | 0.106 | 1.312 |
| V31 | 1.880 | 0.418 | over |
note:DBL:Diagnostic Biotechnology Laboratory Reagent.
SP:Our synthetic peptide reagent.
HEV ORF-2:Expressed product of HEV 9607.
Cut off:0.510(DBL);0.200 (SP);(0.250 HEV ORF-2)
3 讨论
戊型肝炎病毒抗原表位主要分布于第二(ORF2)和第三读框(ORF3)，理想的诊断试剂应包含ORF2及ORF3主要抗原表位，我们曾以合同肽作抗原建立了戊型肝炎病毒抗体诊断方法〔1〕，发现HEV oRF3合成肽免疫反应强，而HEV ORF2合成肽免疫反应性较弱，检出率较低。国外文献报道了许多HEV ORF2合成肽，虽然和HEV抗体有不同程度反应，但反应均较弱，检出率较低。我们也曾表达了HEV oRF2末端42个氨基酸，抗原性较HEV ORF2合成肽强，但和新加坡DBL公司试剂相比仍有差距。根据国外文献报道，HEV ORF2抗原表位主要集中在ORF2第400-660氨基酸中，至少含有四个抗原表位〔1～5〕。因此，我们克隆表达了HEV oRF2第402～660氨基酸。序列分析表明，我们克隆的基因片段和中国新疆株同源性很高，可能属另一株新疆流行株，和缅甸株比较，核苷酸有一定变异，但氨基酸同源性很高。HEV缅甸株为国际上HEV主要亚型之一〔4〕。因此我们克隆表达的基因抗原可能具备较好的反应谱。采用pGEX-3X载体表达谷胱甘肽S-转移酶-戊肝结构区蛋白融合蛋白，主要是为了便于谷胱甘肽Sepharose-4B亲合层析柱纯化，获得高纯度抗原。初步应用表明，HEV oRF2重组蛋白和戊肝抗体的阳性血清反应比新加坡DBL试剂和我们以前合成的合成肽试剂强，新加坡DBL试剂中HEV ORF2重组抗原仅为ORF-2下游末端42个氨基酸，而我们表达的抗原为ORF2下游末端402-660氨基酸，比新加坡DBL oRF2抗原含有更多的抗原表位。我们合成的抗原以HEV ORF3为主，对国外试剂检测弱阳性及中度阳性血清，反应较弱，甚至有个别漏检。实验结果证明：HEV ORF2重组抗原对这些血清反应均较强，阴阳反差明显。对ORF3抗原有很好的互补和增强作用。
参 考 文 献
1 戎广亚，乔小江，张建宗，等.以合成肽作抗原的酶联免疫吸附法诊断戊型肝炎病毒感染.中华医学检验杂志，1994，17：75-77.
2 戎广亚，杨守纯，许建华，等.利用双扩增聚合酶链反应检测非甲非乙型肝炎患者血清中丙型肝炎病毒RNA.中华实验和临床病毒学杂志，1994，8：252-255.
3 Sambrook J,Fritish E F,Maniatis T.Molecular Cloning:A Laborarory Manual.2nd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory press,1989.
4 Tam A W,Smith M M,Guerra M E,et al.Hepatitis E Virus(HEV):Molecular cloning and sequencing of the full-length viral genome.Virology,1991,185:120-131.
5 毕胜利，刘崇伯，曹学义，等.我国戊型肝炎病毒基因组cDNA全序列测定及分析.病毒学报，1992，8：271-279.