不同的样本处理方法对乙型肝炎病毒DNA检测的影响

【摘要】　目的　探讨乙型肝炎病毒(HBV)的聚合酶链反应(PCR)常规检测中血清样本的最佳处理方法。方法　分别用不同缓冲液(PBS与TE)对血清进行1:1或1:10稀释，不同浓度去污剂(Triton X-100与NP40)及巯基乙醇处理血清样本，以及用硫氰酸胍-酚-氯仿抽提、蛋白酶K消化、碱裂解、辛酸钠裂解等方法处理血清样本，比较这些方法对PCR法检测血清HBV DNA敏感度的影响，并进行了辛酸钠最适浓度实验。结果　在所比较的18种方法中发现硫氰酸胍-酚-氯抽提法、碱裂解法及辛酸钠法有较高的检测敏感度，而辛酸钠法有更好的重复性，方法最为简便。结论　终浓度30～50mmol／L辛酸钠最适用于PCR法常规检测HBV DNA的血清处理。

　　Effect of varied sample treatment procedures on detection of hepatitis B virus DNA　Wang Huimin,Xie Xiaoqian. Affiliated Hospital of Nantong Medical College,Nantong City,Jiangsu Province 226001

　　Abstract　The detective sensitivity vary obviously in the assay of HBV DNA by means of polymerase chain reaction with 18 different sample treatment procedures.Higher sensitivity was found in three methods, namely,guanidine thiocyanate/phenol/chloroform,NaoH denaturation and sodium octanoate.The procedure of phenol／chloroform was too labor-intensive to be accepted in routine clinical testing, sodium octanoate which may suppress the inhibitory effect of denatured albumin on the polymerase chain reaction and thus the sensitivity was higherthan the method of NaOH denaturation.Treatment of samples with 30～50mmol／L of sodium octanoate in final concentration for the detection of HBV DNA has shown to be very sensitive, simple and reproducible.

　　Key words:　Hepatitis B virus　　Polymerase chain reaction　　DNA,viral

　　聚合酶链反应(PCR)检测血清中乙型肝炎病毒(HBV)DNA时，由于使用不同的样本处理方法，检测敏感度可出现较大差异。我们比较了文献介绍的常用样本处理方法，并就直接检测法中如何消除变性白蛋白对聚合酶链反应的影响进行了探讨。

　　1　材料和方法

　　1.1　血清标本　取5份临床检测HBV阳性血清混合后，以同一份混合的正常血清1:10系列稀释后进行实验。

　　1.2　样本处理方法　①稀释法：将待测血清与相应缓冲液1:1或1:10混合，99℃15分钟，离心后取上清；②去污剂处理法：将不同浓度去污剂按1:2与待测血清混合，99℃15分钟，离心后取上清；③碱裂解法：血清中加入终浓度为0.1mol／LNaOH,混匀，37℃60分钟，加入等mol HCl混匀，99℃15分钟，离心后取上清；④蛋白酶K消化法：血清与蛋白酶K裂解液1:1混合(终浓度为10mmol／L EDTA，10mmol／L Tris-HCl,pH8.0,0.5%SDS，200μg／ml蛋白酶K)，55℃2小时，99℃15分钟，离心后取上清，或再用酚-氯仿抽提；⑤硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法：50μl血清中加入50μl裂解液(4mol／L硫氰酸胍，25mmol／L枸橼酸钠，pH7.0,0.5%Sacosy1)，加100μl碱饱和酚与25μl氯仿异戊醇，按常规方法抽提；⑥辛酸钠法：120mmol／L辛酸钠水溶液20μl，加入血清40μl，充分混匀，99℃15分钟，16?000r/min离心15分钟，取上清用于扩增。

　　1.3　引物　扩增靶DNA为前C与C区的保守区，上游引物为5'TTG CCT TCT GAC TTC TTT CC，下游引物5'CGA GGG AGT TCT TCT TCT AG，产物437bp,引物由中科院上海细胞所合成。

　　1.4　扩增方法　10μl样本裂解上清液，加入40μlPCR反应液，终浓度为200μmol／L dNTP，10mmol／L Tris-HCl,pH8.0,50mmol／L KCl,0.01%明胶，1.5mmol／L MgCl₂，上、下游引物各0.32μmol／L，2U Taq酶(华美公司)。在PE9600上94℃变性2分钟后，94℃40秒、55℃40秒、72℃55秒循环35次，72℃5分钟。溴乙锭琼脂糖凝胶电泳观察结果。

表　1　各种样本处理方法在血清不同稀释时HBV DNA结果

Tab.1　Results of HBV DNA in different diluent sera with varied sample treatment procedures

编号	方法	血清：裂解液	103	104	105	106	107	108	109	1010	阴性对照
Number	Metbod	Serum:solution									Negative control
1	0.1mol／LPBS	1:1	+	+	+	+	-	-	-	-	-
2	0.1mol／LPBS	1:9	+	+	+	+	-	-	-	-	-
3	TE	1:1	+	+	+	-	-	-	-	-	-
4	TE	1:9	+	+	+	-	-	-	-	-	-
5	NaOH denaturation	1:1.5	+	+	+	+	+	-	-	-	-
6	0.3%NP40	2:1	+	+	+	-	-	-	-	-	-
7	1.5%NP40	2:1	+	+	-	-	-	-	-	-	-
8	3%NP40	2:1	+	+	-	-	-	-	-	-	-
9	0.3%2-Mercaptoethano	2:1	+	+	+	-	-	-	-	-	-
10	1.5%2-Mercaptoethanol	2:1	+	+	-	-	-	-	-	-	-
11	3%2-Mercaptoethanol	2:1	+	-	-	-	-	-	-	-	-
12	0.3%Triton X-100	2:1	+	+	+	+	-	-	-	-	-
13	1.5%Triton X-100	2:1	+	+	+	+	-	-	-	-	-
14	3%Triton X-100	2:1	+	+	+	+	-	-	-	-	-
15	Proteinase K	1:1	+	-	-	-	-	-	-	-	-
16	Proteinase K/phenol／chloroform		+	+	+	+	+	+	-	-	-
17	Cuanidine thiocyanate／phenol／chloroform		+	+	+	+	+	+	-	-	-
18	Sodium octanoate	2:1	+	+	+	+	+	+	-	-	-

　　表　2　不同浓度辛酸钠对扩增效果的影响

　　Tab.2　Effect of different concentrations of sodium octanoate on efficiency of amplification

辛酸钠终浓度 　　Sodium cotanoate 　　(mmol／L)	阳性血清稀释度 　　Dilution of positive serum						阴性对照 　　Negative 　　control
	104	105	106	107	108	109
80	+	+	-	-	-	-	-
60	+	+	+	-	-	-	-
50	+	+	+	+	+	-	-
40	+	+	+	+	+	-	-
30	+	+	+	+	-	-	-
20	+	+	+	-	-	-	-

　　2　结果

　　18种样本处理方法检测不同稀释度HBV DNA阳性血清，结果见表1，不同浓度辛酸钠法处理样本的结果见表2。

　　3　讨论

　　HBV颗粒较小，虽然病毒核酸包绕有二层蛋白质，血清经稀释加热后极易释出核酸，如用PBS稀释，在病毒高浓度时有较好效果。TE稀释法经加热变性后，蛋白质沉淀不完全，离心后上清呈胶状，因此效果欠佳。NP40、Triton x-100、β-巯基乙醇是常用的解聚病毒核蛋白试剂，但高浓度时对Taq酶有抑制作用，浓度越高抑制作用越明显。有报告NP40浓度＜0.5%对PCR无影响^〔1〕，但我们仍觉不宜。有作用SDS／巯基乙醇联合裂解，我们发现检测灵敏度仍底，经巯基乙醇或NP40处理的样品极易出现Smear现象^〔2〕，因此认为此类方法不宜用于HBV pCR 的样本处理。碱裂解法由于方法简便，为临床实验室所常用，但由于需加入HCl中和NaOH，样本有较高的盐浓度，可轻度抑制Taq酶活性。该法加入的碱或酸极微量，加量不易准确，导致样本间pH偏差较大，因此本法重复性较差^〔2，3〕。我们曾用碱处理法与辛酸钠法同时处理20份弱阳性血清，结果前者出现了3份假阴性，而后者结果完全一致。碱裂解法加酸时还可出现交叉污染，如加酸后混匀不及时或不彻底，亦可导致敏感度下降。

　　蛋白酶K消化血清后，取上清直接扩增，测定敏感度极低。Vandenvelde等^〔4〕发现用蛋白酶K／NP40或胰蛋白酶／NP40消化细胞或血清，都不如直接加热裂解法有效，推测水解蛋白或变性蛋白酶可抑制Taq酶活力。如蛋白酶K消化后再用酚-氯仿抽提或直接采用硫氰酸胍-酚-氯仿抽提，由于样本浓缩，实际加入PCR反应中的样本量可达50～100μl，因此可使灵敏度极大提高，但该法费时易引起交叉污染。

　　除繁杂的酚-氯仿抽提法外，辛酸钠法有较好的敏感度。Hoch等^〔5〕发现在血浆中加入短链脂肪酸在加热过程中可阻止白蛋白的变性，并可促使变性蛋白的沉淀，使上清中含尽量少的变性蛋白，从而减弱对Taq酶的抑制作用，并发现用辛酸钠法处理血清在反应体系中只要存在一个拷贝HBV dNA即可检测出来^〔2〕。辛酸钠法用于HBV PCR测定的血清处理，简便，敏感，不易发生交叉污染，且重复性好。因此认为是以上诸多方法中最适用的样本处理方法。

参　考　文　献

　　1　步恒富，马立人，刘志红，等.PCR检测HBV-DNA提取方法比较.临床检验杂志，1995，13(5)：259.

　　2　Vandenvelde C,Scheen R,Defoor M,et al.Suppression of the inhibitory effect of denatured albumin on the polymerase chain reaction by sodium octanoate:application to routine clinical detection of hepatitis B virus at its infectivity threshold in serum.J Virol Meth,1993,42(2):251-263.

　　3　Sherman K E,Brien G O,Gutierrez A G, et al. Evaluation of sample preparation methodologies for detection of hepatitis B genomic DNA by PCR. Hepatology,1991,14(4):219A.

　　4　Vandenvelde C,Verstraete M,VanBeers D.Fast multiplex polymerase chain reaction on boiled clinical samples for rapid viral diagnosis. J Virol Meth,1990,30(1):215-227.

　　5　Hoch H,Chanutin A.Albumin from heated human plasma.Arch Biochem Biophys,1954,51:271-276.