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Expression of HCV structural protein in mammalian cells
MA Wenbin, FENG Baifang.
(Institute of Hepatology, People's Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100044, P. R. China)
【 Abstract 】 Objective Expression of structural protein of hepatitis C virus in mammalian cells stably.Methods The HCV structural gene of typeⅡ was amplified by RT-PCR and cloned in to eukaryotic expression vector pcDNA3. Sp2/0 cells were transfected with the constructed vector by calcium phosphate transfection method. The expressed protein was identified by means of immunohistochemistry and Western blot.Results The amplified gene, which is about 1.9kb, includes entire C, E2 gene and part of E1 gene (including the basepare from the first to the 81th of E1 gene and its hydrophilic end). The cells transfected with the constructed vector expressed the HCV structural protein successfully. The expressed protein was found as brown granules in the cytoplasm. In Western blot, three bands could be seen: a single narrow band at the place about 20kD, which is considered as the core protein; the E2 protein was seen as a broad band of approximately 70kD, and an obscure band located at about 17kD, which was considered as the partly expressed E1 protein.Conclusion The HCV structural protein gene cloned in pcDNA3 eukaryotic expression vector can be stably expressed in mammalian cells, which localized in the cytoplasm of the transfected cells. The expression of the HCV structural protein in mammalian cells rollouted the ground for studying the feature of the protein and its immunogenicity.
【 Subject words 】 Hepatitis C virus; Structural protein; Genetic vector
近年来，丙型肝炎病毒（HCV）感染的免疫机制及其基因疫苗的研究成为关注的热点。人们发现，HCV的E2蛋白能刺激机体产生具有中和活性的抗体〔1〕，但也发现E2区具有高度变异性，对于针对不同型和株的抗体是否具有交叉反应尚不十分清楚。而HCV的C蛋白序列在不同的型和株间具有高度保守性，它还是细胞免疫的主要识别位点，其上附加的T和B细胞表位可能起到载体的作用，从而增加E2蛋白的免疫原性，使E2蛋白刺激产生的抗体滴度增高。另外，E2蛋白通常与E1蛋白以二聚体的形式存在〔2〕，E1E2的二聚体结构可能对其抗原性有重要意义；同时E1区本身也存在着T、B细胞的识别表位，且与C蛋白的正确表达有关〔3〕。为了研究各结构蛋白相互作用下的基因免疫效果，我们构建了Ⅱ型中国株HCV结构蛋白的真核表达载体，并在哺乳动物细胞中得到稳定表达。
材料及方法
真核表达载体的构建：用于目的基因扩增的引物设计参照序列HC-C2〔4〕，引物序列见表1。
采用套式RT-PCR的方法，用4对引物从HCV RNA阳性血清中分别扩增CE1区（1～262AA）及E2区（370～739AA）。扩增产物经电泳回收后，先将E2片段克隆入pcDNA3的EcoRⅠ和XbaⅠ两个酶切位点之间，形成p3E2，再将CE1片段插入到p3E2的BamHⅠ和EcoRⅠ位点之间，最终所获得的载体命名为p3C-E2，转化大肠杆菌JM105，经氨苄青霉素筛选、酶切鉴定，获得含CE1E2的阳性克隆，赛百盛公司测序。
表1 RT-PCR的引物序列
Table 1. The sequence of the primers in RT-PCR
| For amplifing fragment CE1 | For amplifing fragment E2 | |
| Extra-primer | ||
| Superior | 5′GAGGAAAACAGATCCGCAA3′ | 5′GCGGGCCTCGCCTACTAT3′ |
| Inferior | 5′GATAGGGTGCTTGCGAGT3′ | 5′GACGACCARSTTCTCT3′ |
| Intra-primer | ||
| Superior | 5′ACATGTGGATCCATGAGCACGAATCCT3′ | 5′CCTGAATTCATGAAGGTTTTAATTGTG3′ |
| Inferior | 5′CCTGATCGAATTCGACGTGACGTCGTGT3′ | 5′GGTCTAGATTACATCCATAAGCAGGC3′ |
The italic is the restriction endonuclease site the black is the starting and stopping cordon HCV结构蛋白在哺乳动物细胞中的表达：以Sp2/0细胞为宿主细胞，用磷酸钙转染法（Gibco公司）将质粒DNA转染细胞，10 h后换新鲜培养基，再继续培养60 h后，用G418(800μg/ml)进行选择培养，转染有p3C-E2的细胞克隆长成后，用含G418(300μg/ml)的培养液进行维持、传代培养。细胞长至90%融合后，收获细胞，取部分进行免疫组化染色，以抗HCV C、E1和/或E2阳性的患者混合血清作为第一抗体，应用YMED公司的SP试剂盒，按产品说明检测目的蛋白的表达情况。同时将一部分细胞用裂解液裂解，裂解产物经SDS-PAGE后，转于硝酸纤维素膜上，以抗HCV C、E1、E2阳性混合血清为第一抗体做Western blot检测，二者均以转染了pcDNA3空载体的细胞作阴性对照。
结果与讨论
扩增的CE1E2片段全长约为1.9kb（其中CE1片段约0.8kb，E2片段约为1.1kb）。构建后的表达载体结构见图1。用BamHⅠ及XbaⅠ可切下约1.9kb的目的基因片段及5.4kb的空载体(图2)。DNA测序证实，目的片段与参考序列间的同源性为90.6%，整个插入片段读码框架正确，内无提前出现的终止密码（图3）。在目的蛋白瞬时表达的免疫化学检测中，转染了含目的基因的重组载体的细胞胞浆内可见散在的棕黄色颗粒，说明目的基因在工具细胞中得到表达，并且位于细胞浆中；而转染了pcDNA3空载体的细胞胞浆内未见棕黄色阳性颗粒，或呈均一淡黄色，与背景底色一致，说明工具细胞内无目的蛋白的表达。Western blot分析可见加有阳性细胞克隆裂解产物的泳道出现3条蛋白质条带：一条Mr约70×103的宽带，一条Mr约20×103的边缘整齐的窄带，以及一条Mr约17×103的较宽的带（图4）。以按HCV结构蛋白氨基酸序列推算出的蛋白Mr为根据并参考有关文献〔5〕，我们推测这3条带分别为E2蛋白、C蛋白和部分表达的E1蛋白。由于E2和E1蛋白在真核细胞中表达时存在糖基化作用，故其在电泳中的表现Mr较无糖基化的相应蛋白偏大，分别处于70×103和17×103左右的位置。又由于糖基化程度不尽一致，所以电泳结果呈现为较宽的条带。
图1 p3C-E2真核表达载体的构建
Fig 1. Construction of the eukaryotic expression vector of p3C-E2
我们构建的表达载体上的目的基因全长约1.9kb，包括了全长的C和E2区基因序列(384～739AA)，及部分E1区序列（191～262AA，包括其形成二聚体的序列249～256AA，大部分抗原和糖基化位点，及E2疏水末端370～384AA），希望通过各蛋白的相互作用，既可增加E2蛋白的抗原性，刺激机体产生高滴度的中和抗体，又可发挥细胞免疫的作用，扩大其针对HCV不同型和株的范围。DNA测序证实，整个插入片段读码框架正确，内无提前出现的终止密码，从而保证了目的蛋白的正确表达，对测序结果与参考序列间进行同源性分析表明，该序列来自Ⅱ型HCV病毒，而流行病学调查证实中国以Ⅱ型HCV病毒为主，因此，该载体具有较大的针对性。在本实验中HCV的结构蛋白得到了稳定表达，其中，由于我们在构建载体时保留了与C蛋白成熟有关的序列（E1的疏水末端〔4〕），使得表达的C蛋白能够加工成熟。实验结果中表达蛋白定位于细胞浆里，Western blot上显示为一条Mr约20×103的窄带也都证实了这一点，从而避免了未成熟的C蛋白定位于细胞核中而可能存在的致癌性，而E2蛋白由于糖基化等因素的影响，显示的条带较宽，Mr约为70×103。至于E1蛋白，由于我们扩增的只是E1的部分序列，其表达产物为一条Mr约17×103的较宽的条带。
图2 p3C-E2质粒酶切鉴定的电泳图谱
Fig 2. The electrophoresis map of p3C-E2 digested with restriction endonuclease
M: lambda DNA/HindⅢ marker；1: The constructed vector treated with restriction endonuclease BamHⅠ and XbaⅠ；2: The bland vector treated with BamHⅠ
图3 目的基因的核苷酸序列分析及其与参考序列的同源性比较
Fig 3. Sequence analysis of the target gene and its homology to the reference sequence HC-C2
The “*” indicate the beginning of E1 and the E2 gene, The black letter “ATG” and “TAA” are starting and stopping codon
图4 表达蛋白的Western blot检测
Fig 4. Western blot analysis of HCV structural protein expressed in Sp2/0 cells
M: Protein molecular weight standards (Gibco BRL)；1: Lysates from cells transfected with p3C-E2 (mixed anti-HCV positive serum)；2: Lysates from cells transfected with pcDNA3 (mixed anti-HCV positive serum)
本实验构建的HCV结构蛋白真核表达载体在哺乳动物细胞中得到稳定表达，为进一步研究HCV结构蛋白的性质及其相互作用下的基因免疫效果奠定了基础。
参考文献
1，Koziel MJ, Dudley D, Afdhal N, et al. Hepatitis C virus (HCV)-specific cytotoxic T lymphocytes recognize epitopes in the core and envelope proteins of HCV. J Virol, 1993, 67:7522-7532.
2，Dubuisson J, Hsu HH, Cheung RC, et al. Formation and intracellular localization of hepatitis C virus envelop glycoprotein complexes expressed by recombinant vaccinia and Sindbis virus. J Virology, 1995, 68:6147-6160.
3，LO Shih-Yen, Mark J Selby, Jing-Hsiungou. Interaction between hepatitis C virus core protein and E2 envelope protein. J Virol, 1996, 70:5177-5182.
4，Wang Y, Okamoto H, Tsuda F, et al. Prevalence, genetype, and an isolate (HC-C2)of hepatitis C virus in Chinese patient. J Med Virol, 1993, 40:254-260.
5，Major ME, Feistone SM. The molecular virology of hepatitis C. Hepatology, 1997, 25:1527-1538.