中华鳖MHC I α2链基因克隆及序列分析

中华鳖MHC I α2链基因克隆及序列分析

中国免疫学杂志 1999年第2期第15卷 遗传免疫学

作者：夏　春

单位：中国农业大学动物医学院传染病与微生物教研室，北京100094

关键词：中华鳖；MHC I；分子标记

　　中国图书分类号　R392.13

　　摘　要　目的：为了探明中华鳖MHC的结构与功能和寻找该种群的分子标记，对中华鳖MHC class I α2基因中由两个半胱氨酸形成二硫键的区域进行了克隆和序列分析。方法：根据人和动物的MHC Ia α2链中两个半胱氨酸侧翼的保守序列设计了混合型引物，采用PCR法从中华鳖基因组DNA中克隆了MHC I α2链(Trsi-BX1)。结果：经氨基酸序列的同源性分析，Trsi-BX1存在抗原多肽结合位点(T-143、K-146、W-147、Y-159)以及β2微球蛋白结合位点(Q-115、A-117、D-119、G-120、D-122)，并与人和动物的MHC Ia α2存在41.1%～63.9%同源性。结论：Trsi-BX1属MHC class Ia类基因，可作为中华鳖种群的分子标记。

Molecular cloning and sequencing analysis of MHC class I alpha 2 domain from soft-shelled turtle(Trinyx sinensis)

　　XIA Chun.

Department of Microbiology and Infection,College of Veterinary Medicine,Chinese Agricultural University,Beijing 100094

　　Abstract　Objective:In order to research the MHC in soft-shelled turtle and looking for a specific marker in vertebrate.Methods:The MHC class I α2 domain clone(Trsi-BX1)was isolated from soft-shelled turtle by PCR using mixed primers based on two highly conserved amino acid(aa)sequence blocks surrounding two cysteine residues in the second domain of MHC class Ia α2 chains of humans,mice,chickens and lizard.The aa sequence similarities between Salmo salar and Xenopus,and lizard,mouse and human.Results:The data indicate that four residues into the antigenic recognition site(T-143、K-146、W-147、Y-159)are conserved,and the β2-microglobulin binding sites (Q-115、A-117、D-119、G-120、D-122) are also conserved in the Trsi-BX1.Conclusion:The Trsi-BX1 is part of the MHC class Ia and may identified in vertebrate using specific marker.

　　Key words　Soft-shelled turtle　MHC class I　Specific marker

　　主要组织相容性复合体(MHC)分为Class I、Class II和Class III，在识别自我和非自我的免疫应答中起着十分重要的作用。其中，MHC I分子的主要功能是与病毒等内源性蛋白多肽结合并向CD8阳性细胞提呈、活化细胞毒T细胞；并促进B细胞分泌抗体^［1］ 。至今，人、鼠MHC I分子的结构与功能已研究得相当清楚，而低等脊椎动物MHC I的研究尚处于起步阶段。Guillemot等1988年克隆了鸡MHC I基因^［2］。Hashimoto等克隆了鲤鱼MHC I基因^［3］，Flejinik等克隆了蛙MHC I基因。这些报道证明了低等脊椎动物的MHC I基因与人类有着20%～35%的同源性，也是由α1、α2、α3、膜通透和细胞质领域5个功能区构成^［4］。并且，在α1和α2链中存在与抗原多肽结合的特有氨基酸，亦可形成肽环与多肽结合。其功能也涉及到了移植排斥反应、对疾病的易感性、遗传标记以及分子进化等范畴。

　　中华鳖(Trinyx sinensis)是我国及东南亚各国传统的养殖动物，其蛋白有抑制肿瘤、降低血脂等药效。为了探明其MHC的结构与功能和寻找该种群的分子标记，本研究对中华鳖MHC class I α2基因中由两个半胱氨酸形成二硫键的区域进行了克隆和序列分析。现报道如下。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料　中华鳖购于北京海淀区中关村。

　　1.2　方法

　　1.2.1　基因组DNA提取　采用断颈法取鳖血，参照Sambrook等方法从血细胞中提取基因组DNA^［5］。

　　1.2.2　引物设计　根据Bio Database CD-ROM (GENETYX-CD, 34-1)基因库中人、鼠、鸡和蜥蜴MHC Ia基因序列，在α2链中两个半胱氨酸的外侧设计混合型引物，正引物序列为5′-CAR HNG ATG TAY GGN TGT-3′,反引物序列为5′-YTT NAR CCA YTC NAT RCA-3′，其中N代表A、T、G或C；Y代表T或C；R代表G或A。

　　1.2.3　PCR　参照Ex Taq PCR试剂盒(日本Takara公司)说明书进行。其中正、反引物各添加100 pmol，模板DNA添加量为 1 μg，PCR反应总体积为 50 μl。PCR程序是首先94 ℃热变性1 min，52 ℃退火1 min，68 ℃延伸 1 min。 所有PCR反应均在PJ 2000型 PCR仪(日本Takara公司)上循环32个周期。

　　1.2.4　克隆与测序　PCR产物以2% 琼脂糖电泳，采用GENECLEAN试剂盒(BIO 101公司)回收后，与T-easy载体（Promega公司） 连接，转化XL-F′大肠杆菌（Stratagene公司）；再用QIAEX II 试剂盒 (Qiagen公司)提取重组质粒，采用ABI PRISM Dye Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit和ABI 377型DNA自动测序仪（均为Perkin Elmer公司产品）测定克隆片段的核苷酸序列。

　　1.2.5　同源性分析　采用GENETYX 7.3软件在Power Macintosh 9500微机上进行有关分析。

　　2　结果

　　2.1　克隆与测序　采用混合型引物进行PCR扩增后得到了一条与预定大小222 bp相同的片段，插入T-easy载体、3次测序结果如图1所示，克隆片段共222 bp, 74个氨基酸，定名为Trsi-BX1。其中，两个半胱氨酸区域内共186 bp, 62个氨基酸。

　　2.2　序列分析　中华鳖MHC I α2（Trsi-BX1）序列与人、鼠、鸡、蜥蜴、蛙和虹鳟 MHC Ia α2链比较结果如图2所示^{［2，6-10］}，参照人HLA-A2 序列顺序号，Trsi-BX1在96～101、112～122、134～148和159～169区域相对保守。在两个半胱氨酸的内侧区，存在与抗原多肽结合的Thr-143、Lys-146、Trp-147、Tyr-159位点。

　　2.3　同源性分析　Trsi-BX1与人、鼠、鸡和蜥蜴等MHC Ia同源性比较结果如表1所示，Trsi-BX1与人有46.7%同源性，与鼠47.2%、鸡52.8%、蜥蜴63.9%、蛙41.1%、虹鳟52.6%同源。其中Trsi-BX1与蜥蜴同源性最高。

　　3　讨论

　　本研究根据动物的MHC Ia α2链序列设计了混合型引物，采用PCR法率先从中华鳖基因组DNA中成功地克隆了MHC Ia α2链(Trsi-BX1)。与X线衍

　　1　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　60

　　CAGCAGATGT ATGGGTGTGA TCTCTGGGAT GATGGCACCA CCGAGGGGTT TGACCAGTTT

　　Q　Q　M　Y　G　C　D　L　W　D　D　G　T　T　E　G　F　D　Q　F

　　120

　　GCCTACGATG GGCGAGACTT CGTCAGCTTC GACAAGGACA CGCTGACGTG GACGGCGACG

　　A　Y　D　G　R　D　F　V　S　F　D　K　D　T　L　T　W　T　A　T

　　180

　　GACGCTGGAG CGCAGGCAC CAAGCAGAAA TGGGAGGCTG AGAGAGCTTT CCTGCAGAGT

　　D　A　G　A　Q　V　T　K　Q　K　W　E　A　E　R　A　F　L　Q　S

　　222

　　GATAAGAACT ACCTGGAGCA GATCTGCATC GAGTGGCTTAAA

　　D　K　N　Y　L　E　Q　I　C　I　E　W　L　K

图1　中华鳖MHC I α2（Trsi-BX1） 克隆的核苷酸和氨基酸序列

　　Fig.1　Nucleotide sequence and amino acid of the Trsi-BX1 from soft-shelled

　　图2　中华鳖MHC I α2（Trsi-BX1）与人和动物MHC Ia α2链氨基酸序列比较

　　Fig.2　Alignment of MHC class I alpha 2 chain from the Trsi-BX1 and different vertebrate

　　表1　中华鳖MHC I α2（Trsi-BX1）与人和动物MHC Ia α2链氨基酸同源性分析

　　Tab.1　Similarities of amino acid sequences between various MHC class I α2 chain molecules

	Trsi-BX1	HLA-A2	HA12	Gaga-B-F12	Amam-LC1	Xela-UAAlf
HLA-A2	46.7%
HA12	47.2%	69.3%
Gaga-B-F12	52.8%	48.0%	50.7%
Amam-LC1	63.9%	46.1%	47.4%	48.0%
Xela-UAA1f	41.1%	36.8%	36.8%	48.0%	44.4%
Sasa-p30	52.6%	37.2%	33.3%	43.6%	47.4%	41.8%

　　射人HLA-A2（α2链）晶体结构和病毒抗原多肽结合位点以及其它动物MHC Ia相比^{［2-4，6-11］} ，Trsi-BX1在长度上与人、鼠相同，与蛙、鸡和虹鳟不同，存在碱基的插入或缺失变异，存在相对保守区和变异区。其中Trsi-BX1链中存在与抗原多肽结合位点即143位苏氨酸、146位赖氨酸、147位色氨酸和159位酪氨酸。存在β2微球蛋白结合位点即115位谷氨酰胺、117位丙氨酸、119位天冬氨酸、120位甘氨酸和D-122位天冬氨酸。另外，也存在与组氨酸形成盐桥的129位天冬氨酸。因此笔者认为Trsi-BX1具有提呈抗原多肽的功能，属MHC class Ia类基因。

　　在动物的系统发生中，免疫系统出现的相当早，而MHC分子大约在4～5亿年前在低等脊椎动物中出现。然而，MHC I分子因存在与β2微球蛋白和CD8 T细胞受体结合位点，而且，需要特定的氨基酸来维持自身立体结构，因此，它的变异和进化速度受到了一定限制。从这种意义上考虑，笔者认为Trsi-BX1可以作为中华鳖群体的分子标记，但这仍将在种群调查、亲缘关系分析中进一步证实。

　　Trsi-BX1与人有46.7%同源，与鼠47.2%、鸡52.8%、蜥蜴63.9%、蛙41.1%和虹鳟52.6%同源。这种同源性的比较基本显示了动物的系统分类地位，即中华鳖Trsi-BX1与蜥蜴同源性最高, 同属爬行类。然而，Trsi-BX1与鸡也有52.8%、与虹鳟也有52.6%同源性，这可能是因为爬行类、鸟类以及鱼类在长期适应大自然环境、抵抗共患病原的过程中MHC class I分子的变异和进化有着某种共同的走向，这有待深入研究。

　　作者简介：夏　春，男，35岁，副教授，博士后，主要从事动物免疫学与微生物学研究

　　4　参考文献

　　1　Parham P, Lawlor D A, Lomen C E et al. Diversity and diversification of HLA class I alleles. J Immunol, 1989; 142: 3937

　　2　Guillemot F, Billault A, Porquie O et al. A molecular map of the chicken MHC: the class II beta genes are closely linked to the class I genes and the nuclear organizer. EMBO J，1988； 7: 2775

　　3　Hashimoto K, Nakanishi T， Korosawa K. Isolation of carp genes encoding major histocompatibility complex antigens. Proc Natl Acad Sci USA, 1990; 87: 6863

　　4　Flajnik M F， Canel C, Kramer J et al.Evolution of the major histocompatibility complex: Molecular cloning of major histocompatibility complex class I from the amphibian Xenopus. Proc Natl Acad Sci USA, 1991; 88:537

　　5　Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor, 1989：464

　　6　Koller B H， Orr H T. Cloning and complete sequence of an HLA-A2 gene: analysis of two HLA-A alleles at the nucleotide level. J Immunol, 1985; 134: 2727

　　7　Lalanne J L, Delarbre C, Gachelin G et al. cDNA clone containing the entire coding sequence of mouse H-2K^d histocompatibility antigen. Nucleic Acids Res, 1983; 11: 1567

　　8　Grossberger D ， Parham P. Reptilian class I MHC genes reveal conserved elements in class I structure. Immunogenetics, 1992; 36: 166

　　9　Shum B P, Avila D, Du Pasquier L et al. Isolation of a classical MHC class I cDNA from an amphibian. J Immunol, 1993; 151: 5376

　　10　Grimholt U, Hordvik I, Fosse V M et al. Molecular cloning of major histocompatibility complex class I cDNAs from Atlantic Salmon(Samo Salar). Immunogentics, 1993; 37: 469

　　11　Bjokman P J, Saper M A, Samraoui B et al. Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2. Nature, 1987; 329: 506

〔收稿1997-09-29　修回1998-02-24〕