跨膜突变型TNF-α的基因构建及体外表达①

跨膜突变型TNF-α的基因构建及体外表达①

中国免疫学杂志 1999年第6期第15卷 分子与细胞免疫学

作者：曾劲杨　李卓娅　龚非力　徐　勇　熊　平

单位：同济医科大学免疫学教研室，武汉430030

关键词：跨膜型TNF-α(TM-TNF-α)；跨膜型TNF-α突变体(TM-TNFm-α)；一次PCR定位突变(S-PCR)；体外转录翻译

　　摘　要　目的：跨膜型TNF-α(TM-TNF-α)易在某些蛋白酶的作用下转换为分泌型TNF-α(S-TNF-α)。拟用基因突变技术获得稳定表达的、不能转换成S-TNF的TM-TNF突变体(TM-TNFm)。方法：应用RT-PCR技术，从人外周血单核细胞中扩增出编码TM-TNF-α的全长cDNA序列并构建pBSK-TNF-α重组体。以此为模板，借助改进的“一次重组PCR”定位突变技术，造成TM-TNF转换为S-TNF酶切位点的缺失，获得TM-TNF突变重组体(TM-TNFm)。结果：将TM-TNFm cDNA片段克隆至表达载体pGEM-3Zf，利用体外转录翻译系统表达出具有生物学活性的跨膜突变型TNF-α蛋白。经Western blot分析证实，用胶原酶不能将TM-TNF突变体酶解成为S-TNF。结论：提示所构建的TM-TNFm去除了可转换为S-TNF的酶解氨基酸序列，为进一步研究跨膜型TNF杀瘤作用奠定了基础。

　　中国图书分类号　R392.11

Construction and in vitro translation of transmembrane tumor necrosis factor-α

　　mutant gene

ZENG Jin-Yang, LI Zhuo-Ya, GONG Fei-Li et al.

　　Department of Immunology,Tongji Medical University,Wuhan 430030

　　Abstract　Objective：Transmembrane TNF-α (TM-TNF-α) can readily be converted by certain proteinase into secretary TNF-α(S-TNF-α). Therefore, in the present study, the authors attempt to make use of mutagenesis technique for constructing a kind of stable expressed TM-TNF mutant (TM-TNFm) which would not be cleaved into S-TNF.Methods: A full length of TM-TNF-α cDNA was amplified from the human monocytes by RT-PCR and cloned into plasmid pBSK to construct recombinant pBSK-TM-TNF. pBSK-TM-TNF-α mutant was then obtained by deletion of enzymatic site for conversion of TM-TNF into S-TNF-α with the site-directed mutagenic method of modified "Single-Step PCR".Results: The mutant was subcloned into expression plasmid pGM-3Zf and then in vitro transcribed and translated into protein which displayed its biological activities. As shown by Western blot, TM-TNF mutant could not be speciafically hydrolyzed into S-TNF by collagenase. Conclusion:These results suggested that TM-TNFm produced was indeed void of the amino acids sequence that could be enzymatically cleaved laying a foundation for the further study on the anti-tumor activity of TM-TNF.

　　Key words　Transmembrane TNF-α(TM-TNF-α)　Transmembrane TNF-α mutant (TM-TNFm-α)　Site-directed mutagenesis by single-step PCR　In vitro translation

　　肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以17 kD分泌型（S-TNF-α）和26 kD跨膜型（TM-TNF-α）二种形式存在^［1］。目前研究表明，TM-TNF主要是通过细胞-细胞间直接接触发挥局部生物学效应，其毒副作用较小，且可介导对S-TNF耐受细胞株的细胞毒作用^［2,3］，这就为肿瘤的生物学治疗提供了新途径。但是TM-TNF-α是S-TNF-α的前体，易在某些蛋白酶的作用下转换为S-TNF^［4］。为避免S-TNF的全身毒副作用,本研究用基因定点突变技术造成编码该酶切位点的核苷酸序列缺失，以获得稳定表达的、不能转换成S-TNF的TM-TNF突变体(TM-TNFm)。

　　1　材料与方法

　　1.1　质粒、菌株、酶及主要试剂　质粒pbluescriptK(pBSK)和pGEM-3Zf及大肠杆菌E. coli TG1、JM109由本教研室收藏。AMV逆转录酶(美国GIBCO公司)；限制性内切酶(Hind Ⅲ, BamH I)、T4 DNA连接酶、体外转录翻译系统、非同位素体外翻译检测系统及犬胰腺微粒体(美国promega公司)；Tag DNA聚合酶(德国BNC公司)；m⁷ G(5′)ppp(5′)G(德国Boehringer Mannheim公司)。

　　1.2　重组pBK-TM-TNF的构建　按常规方法从人静脉血中分离单核细胞，LPS（100　ng/ml）刺激3　h后，提取细胞总RNA^［5］。以此为模板，利用TM-TNF专一性引物(5′端引物为-GCGGATCCATGAGCACTGAAAG-

　　CATGATCC,3′端引物为CCCAAGCTTCAGGGCAATG-

　　ATCCCAAAGTA，德国Essen大学提供), 进行RT-PCR反应，反应总体积50 μl。反应条件为：94℃变性1 min，60℃退火1 min， 72℃延伸1 min，共30次循环；PCR产物纯化分离后，经BamH I/Hind III双酶切，与载体pBSK/BamH I+Hind III连接,并转化至大肠杆菌TG1中。得到重组质粒pBSK-TM-TNF-α。

　　1.3　一次重组PCR定位突变法（S-PCR　method)　以重组质粒pBSK-TM-TNF为模板(0.1 μg)，在缺失部位两侧设计一对引物，5′端引物为GTAGCCCATGTTGTAGCAAAC，3′端引物为TGCCTGGGCCAGAGGGTT-

　　GAT(由本校分子生物学教研室合成)，PCR反应成分同上。PCR扩增条件为：94℃ 1 min，64℃ 2 min，72℃ 4 min，共35个循环。PCR产物纯化回收^［6］后,用大片段Klenow酶室温处理1 h；酚/氯仿抽提后，用T4 DNA连接酶（20 U, 16℃孵育24 h）使线性DNA分子自身环化，再转化至大肠杆菌TG1，获得的克隆用TM-TNF特异性引物作PCR扩增，并与TM-TNF的PCR产物比较，初步筛选出突变重组体。

　　1.4　核苷酸序列的测定　采用PCR-双脱氧链终止法，在ABI 373a DNA测序仪上进行序列测定。

　　1.5　体外表达重组质粒的构建　将TM-TNFm cDNA片段克隆至表达载体pGEM-3Zf/Hind III，BamH I；转化大肠杆菌JM109，得到pGEM-3Zf-TM-TNFm重组质粒。

　　1.6　重组质粒的体外转录和翻译　按照体外转录系统试剂盒的实验指南进行操作，在T7 RNA聚合酶的作用下将质粒DNA体外转录成带帽mRNA。然后应用兔网织红细胞裂解物体外翻译试剂盒，以tRNAnscend^TM tRNA为体外翻译合成特异性蛋白产物的标记物，在犬胰腺微粒体存在的条件下体外合成TM-TNFm。同时体外翻译合成TM-TNF未突变体作为对照。

　　1.7　Western blot分析　取适当体外翻译产物进行15% SDS-PAGE凝胶电泳；然后采用半干电转移法将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维膜上；借助非同位素体外翻译检测系统，通过显色反应鉴定出体外翻译的特异性产物。

　　2　结果

　　2.1　TM-TNF和TM-TNFm 重组体的构建　用TM-TNF引物对突变重组质粒作特异性PCR扩增，并与TM-TNF的PCR扩增产物进行比较，其电泳结果见图1a。第4,5泳道是从突变重组体中扩增出的条带，约在676～1 198 bp处，与第2,3泳道的TM-TNF扩增产物相比，分子量略小，这与TM-TNFm cDNA的理论值（666 bp)基本相符。突变重组体用BamH I和Hind III双酶切后，可得到一个约0.67 kb的cDNA插入片段（见图1b）。进一步对重组体pBSK-TM-TNF及pBSK-TM-TNFm进行核苷酸序列分析，结果证实，通过S-PCR突变技术获得的TM-TNFm被删除了编码分泌型TNF的Val⁺¹～Pro⁺¹²位的所有密码子，共36个碱基。

图1　TM-TNF与TM-TNFm PCR扩增产物及pBSK-26 kD TNFm重组子的酶切电泳图谱

　　Fig.1　Electrophoresis analysis of TM-TNF and TNF-TNFm PCR products as well as enclonuclease digested recombnant mutant

　　Note:a)1.PGEM DNA marker;2,3.PCR products of TM-TNF;4,5.PCR products of TM-TNFm.b)1.λDNA／Hind Ⅲ+Eco RI Marker;2.pBSK-26kD TNFm+Bam H I+Hind Ⅲof TM-TNFm

　　2.2　在体外转录表达翻译系统中表达TM-TNFm蛋白　用兔网织红细胞体外翻译系统，在犬胰腺微粒体膜存在的条件下，分别在体外翻译合成TM-TNF及TM-TNF突变体。经Western blot分析，结果如图2所示。可见，体外合成的TM-TNF分子量为26.0 kD，而体外合成的TM-TNFm分子量略小于TM-TNF；通过对靶细胞L929及HL60作胞毒活性检测，表明体外表达的TM-TNFm蛋白产物具有生物学活性（1 000 U/ml)。

图2　体外翻译产物Western blot分析

　　Fig.2　Western blot analysis of in vitro translation products

　　Note:1.protein marker ;2.TM-TNF protein;3.TM-TNFm protein;4.17.0 kD S-TNF protein

　　2.3　体外合成的TM-TNF及其突变体的酶解分析　将体外翻译产物26.0 kD TNF及其突变体分别用胶原酶和胰蛋白酶处理，再进行Western blot分析。结果如图3，胶原酶可将体外合成的26.0 kD TNF转变为17.0 kD蛋白分子；但对26.0 kD TNFm无降解作用(第3,6泳道)。以上两种体外翻译蛋白经胰蛋白酶作用后均被分解成约16.0和13.5 kD两个小片段(第4,7泳道)。

图3　经蛋白酶处理的体外翻译产物TM-TNF及其突变体的Western blot 分析Fig.3　Western blot analysis of in vitro translation products of

　　tM-TNF and its mutant treated with proteinase

　　note:1.protein marker;2.TM-TNF;3.TM-TNF+collagenase;4.TM-TNF+trypsin;

　　5.TM-TNFm;6.TM-TNFm+collagenase;

　　7.TM-TNFm+trypsin;8.17.0 kD S-TNF

　　3　讨论

　　由于S-TNF可进入血循环,引起全身的毒副作用,故极大地限制了它在临床的应用。近年来本实验室证实TM-TNF除了有更广的杀瘤谱外,其杀瘤方式主要引起凋亡，而S-TNF则主要引起坏死(待发表),故TM-TNF显示出比S-TNF有更好的杀瘤作用，而且其安全性较高。但是TM-TNF是S-TNF的前体,Perez报道，26 kD TNF分子有2个可被降解成17.0 kD TNF的酶切位点^［2］。为了保留TM-TNF而又阻止S-TNF的产生,本研究借助体外定点突变技术删除编码+1～+12位氨基酸的密码子,以获得能表达不可转换的TM-TNF突变体。本文采用改进的“一次重组PCR"技术^［7］，仅用一对引物进行一次PCR扩增，即可获得所需的突变DNA重组体。该技术将定位突变与基因克隆技术结合起来，具有快速、经济等特点，不失为对基因定位突变技术的一次有益探索。用体外转录翻译系统合成的TM-TNFm，经对L929及HL60细胞系作胞毒活性检测，表明经突变删除了12个氨基酸(Val⁺¹～Pro⁺¹²)的TM-TNFm仍然保留有同未突变TM-TNF一样的生物学活性，说明被删除的氨基酸序列不影响TM-TNFm结合相应的受体,并引起功能性信号传导。目前研究证明某些基质类金属蛋白酶(matrix metalloproteinase MMPs)在两型TNF分子转换过程中可能起重要作用^［4］。为了确定该序列的缺失是否使TM-TNFm不再会转换成S-TNF，我们选择胶原酶（作定点酶解）和胰蛋白酶（作非定点酶解）分别处理体外合成的26.0 kD TNF及其突变体。实验结果表明，胶原蛋白酶能定点将未突变TM-TNF水解成S-TNF分子，而对TM-TNF突变体则无水解作用。但胰蛋白酶能将这两种TM-TNF（突变和未突变的）均酶解成两个小片段。这提示所构建的TM-TNFm恰好突变去除了可转换为S-TNF的酶解氨基酸序列，而对其他序列无影响。从而为进一步研究跨膜型TNF杀瘤作用奠定了基础，也为研究TM-TNF的生物学特点及其作用机制，以及比较跨膜型与分泌型TNF的生物学效应,提供了实验模型。

　　①本课题为国家自然科学基金资助项目(批准号：39270314)

　　作者简介：曾劲杨，女，28岁，免疫学博士研究生；

　　指导老师，龚非力，男，教授（博士生导师），主要研究分子免疫学；

　　李卓娅，女，教授，主要研究分子免疫学

　　4　参考文献

　　1　 Kriegler M, Perez C, Defay K et al. A novel form of TNF/Cachectinis a cell surface cytotoxic transmembrane protein: remification for the complex physiology of TNF. Cell，1988; 53:45

　　2　 Perez C, Albert I,DeFay K et al. A nonsecretable cell surface mutant of TNF kills by cell-to cell contact . Cell, 1990; 65: 251

　　3　 Peck R, Brockhaus M, Frey J R et al. Cell surface tumor necrosis factor accounts for monocyte and lymphocyte-mediated killing of TNF resistant target cells . Cell Immunol, 1988; 122:1

　　4　 Gearing A J H, Beckett P, Christodoulou M et al. Processing of TNF-α precursor by metalloproteinase. Nature, 1997;370: 555

　　5　 Li Z, Davis G S, Mohr C et al. Suppression of LPS-induced tumor necrosis factor-α gene expression by microtubule disrupting agents. Immunobiol,1996; 195: 640

　　6　 卢圣栋主编. 现代分子生物学实验技术.北京：高等教育出版社， 1993： 672

　　7　 林万明主编. PCR技术操作和应用指南.北京：人民军医出版社，1995： 231

〔收稿1997-12-04　修回1998-03-20〕