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【摘要】 目的 探讨肿瘤坏死因子(TNF)-α基因与氟尿嘧啶(5-FU)联合治疗胰腺癌的作用。方法 应用MoMLV逆转录病毒载体，将TNF-α基因转导致人胰腺癌细胞株PC-3，经氨基糖甙类新霉素衍生物Geneticin(G418)筛选获得了抗性克隆。用逆转录聚合酶链方法检测胰腺癌细胞株转染TNF-α的基因表达情况，同时用放线菌素D处理后的小鼠成纤维肉瘤细胞L929检测转基因细胞表达TNF-α的活性，并观察TNF-α基因和5-FU联合治疗胰腺癌的协同作用。结果 TNF-α基因在人胰腺癌中整合并表达有活性的TNF-α。转染TNF-α基因的细胞生长受抑制。TNF-α基因与5-FU联合应用提高了对胰腺癌的抑制作用。结论 TNF-α基因与5-FU联合应用对胰腺癌增殖的抑制有协同作用，并可减少5-FU的药量，对胰腺癌的综合治疗有潜在的临床应用价值。
Combination therapy of pancreatic cancer with tumor necrosis factor alpha gene and5-Fluorouracil
ZHANG Qunhua, NI Quanxing, FU deliang, et al.
(Center for Pancreatic Cancer, Huashan Hospital, Shanghai Medical University, shanghai 200040, China)
【Abstract】 Objective to investigate the synergistic antitumor effects of tumor necrosis factor alpha(TNF-α) gene and 5-Fluorouracil (5-FU) therapy in pancreatic cancer.Methods retroviral vector MoMLV was used to introduce human TNF-a gene into human pancreatic carcinoma cell line PC-3. The G418-resistant colonies were isolated and cloned. Expression of TNF-a gene was evaluated by RT-PCR. The activity of tNFa expressed by transducted pancreatic cancer cell strain was measured by rat fibrosarcoma cell L929 which was processed by Actinomycin D. Finally the synergistic antitumor effects of TNF-a gene and 5-FU were observed.Results rT-PCR analysis indicated that the integration and expression of TNF-a gene was seen only in the transducted cells. Using a bioassay method, different gene transducted PC-3 cells can secrete different amount of TNF-a.Growth of the cells transfected with TNF-α gene was inhibited. A combination of TNF-α and 5-FU could increase the inhibitory effects on pancreatic carcinoma.Conclusion combination therapy with TNF-a gene and 5-FU has synergism to inhibit pancreatic cancer cell proliferation, which can decrease the dose of 5-FU, and has potential value to clinical treatment of pancreatic cancer.
【Key words】 Human tumor necrosis factor; gene moddification; Human pancreatic carcinoma; 5-Fluorouracil
我们采用逆转录病毒介导肿瘤坏死因子(TNF)-α基因修饰人胰腺癌细胞后联用氟尿嘧啶(5-FU)，旨在为胰腺癌基因治疗提供新的应用策略。材料和方法
1.基因转染：逆转录病毒载体人工包装TNF-α质粒(PLhTNF-α sN)含有内切酶EcoRI和BamHI位点。外源性基因猴病毒40(SV40)为启动因子，NeoR基因为标志基因，TNF-α为目标基因。质粒经大肠杆菌扩增，氯化铯(CsCl)超离心法纯化，采用磷酸钙共沉淀法转染包装细胞系PA317，收集含有TNF-α基因复制缺陷型逆转录病毒上清液转染PC-3胰腺癌细胞(购自北京协和医院)，用氨基糖甙类新霉素衍生物Geneticin(G418)筛选有抗性的细胞克隆。随机挑选细胞克隆1号和4号转染胰腺癌细胞，进行后续试验。
2.TNF-α活性蛋白表达检测：细胞接种量1×105个，在含5 ml培养液的培养瓶中生长5 d，使用Medgenix TNF-α ELISA kit (Medgenix diagnostic公司)，检测细胞培养上清液中TNF-α含量。利用TNF-α对放射菌素D处理后的小鼠成纤维肉瘤细胞L929的溶解作用，检测TNF-α的生物活性。
3.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)：按异硫氰酸胍-酚氯仿一步抽提细胞总RNA(试剂购自Gibco公司)。以下游引物合成cDNA(试剂盒购自Gibco公司)，再以其为模板，进行PCR，若阳性表达者预期可扩增出712 bp长度的片段。选用快速RT-PCR (Promega)。质量分数为1.5%琼脂凝胶电泳检测反应产物，扩增人TNF-α基因引物为，上游引物：5′-CGGGACGTGGAGCTGGCCGAGGAG，下游引物3′-CACCAGCTGGTTATCTCTCAGCTC。
4.TNF-α基因转染胰腺癌细胞的5-FU治疗：TNF-α基因转染胰腺癌细胞后给予5-FU治疗的疗效分析，以未转染的胰腺癌细胞为对照。5-FU治疗剂量为15 mg/L或30 mg/L。
5.细胞体外扩增情况的观察：胰腺癌细胞和TNF-α转染的胰腺癌细胞以1×108个/L分别接种于各15瓶培养瓶中，各组分别加5-FU30 mg/L或15 mg/L。每天取3瓶制成细胞悬液。质量分数为0.2%台盼蓝染色，连续观察5 d，绘制成生长曲线。
6.统计学处理：数据以均数±标准差(±s)表示，χ2检验。
结 果
1.转染TNF-α基因的细胞克隆的建立和表达：培养瓶中未转染TNF-α基因的细胞，经过G418筛选14 d被杀死，转导TNF-α基因的细胞在含有0.3 g/L G418的培养瓶中扩增形成稳定的克隆。PC-3-TNF-α的细胞培养5 d后，未转染的TNF-α胰腺癌细胞培养上清中TNF-α活性仅为10×103 u/L，而转染细胞的上清中TNF-α活性为25×104 U/L，是对照组的25倍。
2.外源基因检测：未转染TNF-α基因的胰腺癌细胞中无明显TNF-α的mRNA，而转染后的胰腺癌克隆细胞中，电泳中有TNF-α mRNA的特异性条带波，证实外源性TNF-α经逆转录病毒载体转染，已有mRNA的表达。
3.TNF-α的活性测定：PC-3/TNF-α的上清对L929细胞裂解70%，标准TNF-α的裂解率为90%， pC-3上清对L929细胞似乎无裂解作用。
4.5-FU和TNF-α转基因对胰腺癌细胞的生长抑制分析：PC-3细胞在低浓度的5-FU(15 mg/L)中生长较单纯转TNF-α的PC-3细胞(P＜0.05)或单用5-FU的PC-3细胞生长缓慢(P＜0.01)，但在高浓度的5-FU(30 mg/L)中，早期生长抑制不明显，而后期有明显的生长抑制(图1)。
讨 论 最近研究表明，胰腺癌的生物学行为与细胞因子参与有关，利用逆转录病毒载体将TNF-α基因转入人胰腺癌细胞，使其分泌有生物活性的TNF-α，期望对胰腺癌细胞产生抑制作用［1,2］。本研究结果显示，人胰腺癌细胞能被TNF-α基因转染，RT-PCR结果表明目的基因均有转录行为发生，且TNF-α基因转染的胰腺癌细胞增殖能力降低。我们认为TNF-α对转染的胰腺癌细胞有直接的抗增殖作用，即产生异化作用，通过转基因的方法，将外源性基因TNF-α转入胰腺癌细胞后利用胰腺癌细胞本身生长无序性和失控状态，表达出对自身有毒性作用的TNF-α导致胰腺癌细胞的逐渐死亡。
5-FU的单药治疗被视作为晚期胰腺癌的标准治疗，其有效率为20%，而其化疗药物的毒副作用制约了该药的大剂量应用。我们的研究结果表明，TNF-α转基因治疗和5-FU联合应用对胰腺癌增殖的抑制有协同作用，并可以减少5-FU的药量，提高该药的疗效，这对胰腺癌的综合治疗有潜在的临床应用前景，值得深入研究。
参考文献
1，Walther W, stein U, Pteil D. Gene transfer of human TNF-α into glioblastoma cells permits modulation of mdr 1 expression and potentiation of chemosensitivity. Int J cancer, 1995,61:832-839.
2，Kimnra M, Tagawa M, Takenaga L, et al. Loss of tumorigenition of human pancreatic carcinoma cells engineered to produce interleukin-2 or interleukin-4 in nude mice. A potentiality for cancer gene therapy. Cancer-lett,1998,128:47-53.