点击显示 收起
逆转录病毒载体介导的人白细胞介素10在大鼠心肌细胞的表达
中国免疫学杂志 1999年第8期第15卷 分子与细胞免疫学
作者：李锦华 陈永雄 张仕光 廖晓星
单位：中山医科大学附属第一医院急诊科，广州510080
关键词：基因转移；逆转录病毒载体；人白细胞介素10；大鼠心肌细胞
摘 要 目的：建立一个在大鼠心肌细胞表达人白细胞介素10(Human Interleukin 10, hIL-10)的重组逆转录病毒载体基因转移系统，为下一步的研究工作做准备。方法：将构建的表达人白细胞介素10的逆转录病毒重组体pLX(hIL-10)SN经PA317细胞包装，G418筛选，NIH3T3细胞进行病毒滴度测定，选滴度最高的克隆(6×105CFU／ml)作为感染大鼠心肌细胞的感染细胞；用重组逆转录病毒感染大鼠心肌细胞，应用聚合酶链反应(PCR)及反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染大鼠心肌细胞DNA及mRNA，应用ELISA测定hIL-10在心肌细胞的表达。结果：外源性hIL-10基因已整合到心肌细胞染色体DNA并有效地转录和翻译，表达水平最高达1 755 ng／(106cells*24 h)。结论：外源性hIL-10基因可以转移到大鼠心肌细胞并稳定表达，为今后研究hIL-10的作用机制及在治疗疾病中的应用打下了基础。
中国图书分类号 Q789
Expression of human interleukin 10 in rat cardiomyocytes by retroviral vector
LI Jin-Hua, CHEN Yong-Xiong, ZHANG Shi-Guang et al. Emergency Department, the First Affiliated Hospital, Sun-yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080
Abstract Objective: To establish a model expressing human interleukin 10 in rat cardiomyocytes(Rat CMC) by retrovial vector for further study.Methods: PLX(hIL-10)SN was introduced into packaging cell PA317, then to select PA317 by G418,to determine retrovirus producer cells titre by NIH3T3 for identification of producer clones making high-titre virus. Exogenous gene hIL-10 was transferred into Rat CMC by the highest titre producer cells clone (6×105CFU／ml). After gene transfer 72 h, DNA and RNA were prepared from transfected Rat CMC for the polymerase chain reaction (PCR) and the reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Expression of hIL-10 in transfected Rat CMC was checked by ELISA. Results: Exogenous hIL-10 gene has been subcloned into retroviral vector pLXSN successfully, exogenous hIL-10 gene has been integrated into the chromosal DNA of the transfected Rat CMC. RT-PCR and ELISA showed that exogenous hIL-10 gene was expressed in the transfected Rat CMC after transfection 48 h and the highest expression level was 1 755 ng／(106cells*24 h).Conclusion: Exogenous hIL-10 gene can be transferred into Rat CMC and be expressed stably. The retroviral vector PLX(hIL-10)SN shall lay foundation for researching hIL-10 mechanism and its application for curing heart diseases.
Key words Gene transfer Retroviral vector Human interleukin 10 Rat cardiomyocytes
白细胞介素10是T辅助细胞产生的以抑制Th1细胞克隆的细胞因子合成为特点的多效免疫调节因子。它具有抑制Th1细胞亚群细胞因子γIFN，IL-2,TNF-α，GM-CSF，LT等的合成；还具有抑制单核细胞中细胞因子如IL-1α，TNF-α，GM-CSF等合成［1］；抑制巨噬细胞产生活性氧的中间体，抑制单核巨噬细胞依赖性NK细胞合成IFNγ和TNFα，抑制单核细胞HLA-II类抗原DR，DP，DQ的表达［2］；抑制B7，细胞粘附分子ICAM-1的表达［3］。动物实验显示IL-10能抑制感染性休克小鼠的TNF-alpha和IL-1的高表达，降低死亡率［4］；用IL-10处理的鼠郎罕氏细胞诱导了T细胞的无应答［5］；以上这些特性表明IL-10具有重要的抗炎及免疫抑制作用，用于治疗免疫介导的炎症性疾病和用于抑制排斥反应具有广阔的应用前景。本实验建立一个在大鼠心肌细胞表达人白细胞介素10的重组逆转录病毒载体基因转移系统，为今后研究hIL-10的作用机制及在治疗疾病中的应用打下了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒，菌株和细胞 大鼠表达人白细胞介素10的逆转录病毒重组体pLX(hIL-10)SN由本室构建［6］；空白载体pLXSN，PA317，NIH3T3：军事医学科学院；Wistar大鼠：中山医科大学实验动物中心。
1.1.2 主要酶和试剂 RT-PCRkit：Promega；PCRkit：华美公司；DOTAP：Boehringer Marmnnheim；G418，DMEM／F12：GIBCO；新生牛血清：杭州四季青生物工程材料研究所，hIL-10 ELISA kit：深圳晶美公司。
1.2 方法
1.2.1 重组逆转录病毒的包装和重组病毒感染滴度测定 将重组质粒pLX(hIL-10)SN和空白质粒pLXSN用DOTAP法导入逆转录病毒包装细胞PA317，培养72 h后，换含400 μg／ml G418的10%新生牛血清进行筛选；待抗G418抗性克隆形成后冻存于液氮中备用。将抗性克隆从液氮取出复苏，待细胞达70%～80%左右汇合时，收集其上清液，以102～104的倍数做系列稀释后，分别感染NIH3T3细胞(感染液中加Polybrene 4 μg／ml)，感染3 h后换液，继续培养72 h后用含800 μg／ml G418的培养基培养14 d。以抗性克隆上清液的稀释倍数乘以存活的抗G418的细胞克隆数为重组病毒感染滴度。单位为CFU／ml(集落形成单位／毫升)。
1.2.2 大鼠心肌细胞的转染 按文献［7］的方法培养Wistar大鼠心肌细胞。待细胞达60%～80%左右汇合时，分别加入上述抗G418抗性克隆pLX(hIL-10)SN和pLXSN上清(感染液中加Polybrene 4 μg／ml)，3 h后换为10%新生牛血清DMEM／F12进行培养；72 h时换为含800 μg／ml G418的选择性培养基培养；3 d后取细胞分别提取DNA和RNA。
1.2.3 目的基因hIL-10在大鼠心肌细胞表达的检测
1.2.3.1 目的基因hIL-10转移至大鼠心肌细胞的检测 取上述转染的大鼠心肌细胞，PBS离心洗涤3次，按文献［8］的方法提取DNA作PCR，以一对引物
图1 转染大鼠心肌细胞 DNA的PCR检测
Fig.1 PCR detection of transfected rat cardiomyocytes DNA
Note:Lane 1.PCR product of Rat CMC DNA (transfected with pLXSN vector)；Lane 2.PCR product of Rat CMC DNA (transfected with pLX(IL-10)SN vector):679 bp；Lane 3.PCR marker
［引物A(pLXSN 1 511～1 530 bp 5′-GTCAAGCCCTTTGTACACCC-3′)，引物C(hIL-10 cDNA 546～525 bp 5′-CCTGATGTCTCAGTTTCGTATC-3′］检测目的基因在大鼠心肌细胞的整合。PCR：Denaturation 93℃×1 min，Annealing 50℃×1 min，extension 72℃×2 min,35 cycles, final extension 72℃×5 min(见图1)。
1.2.3.2 目的基因hIL-10在大鼠心肌细胞转录的检测 按文献［8］的方法提取总RNA，以引物B(hIL-10 cDNA 129～150 bp)，5′-TCTCCGAGATGCCTTCAGCAGA-3′)，引物C(见上)作RT-PCR，检测目的基因hIL-10在大鼠心肌细胞的转录。以一对引物(Sense：21～40：5′-CATAGACAAGATGGTGAAGG-3′，Anti-sense：590～517：5′-TCCACAGTCTTCTGAGTGGC-3′)扩增大鼠看家基因GAPDH的mRNA为阳性内参照(Sense 21～40 bp，5′-CATAGACAAGATGGTGAAGG-3′，Anti-sense 590～571 bp，5′-TCCACAGTCTTCTG AGTGGC-3′，570 bp)。反转录后PCR方法同上(见图2)。
1.2.3.3 目的基因hIL-10在大鼠心肌细胞的表达 按照ELISA kit提供的方法检测目的基因hIL-10在大鼠心肌细胞的表达。
图2 转染大鼠心肌细胞RNA的RT-PCR检测
Fig.2 RT-PCR detection of transfected rat cardiomyocytcs mRNA
Note:Lane 1.Internal control:RT-PCR product of Rat GAPDH mRNA:570 bp；Lane 2.RT-PCR product of Rat CMC mRNA (transfected with pLXSN vector)；Lane 3.RT-PCR product of Rat CMC mRNA (transfected with pLX(IL-10)SN vector):418 bp；Lane 4.PCR marker
2 结果
2.1 重组逆转录病毒的包装及重组病毒滴度测定 未转入pLX(hIL-10)SN或pLXSN的PA317细胞，经选择性培养后，在3至7 d内死亡，而转入pLX(hIL-10)SN或pLXSN的PA317细胞存活，形成抗性克隆。经NIH3T3测定，其最大感染滴度6×105CFU。
2.2 目的基因在转染大鼠心肌细胞的表达
2.2.1 转染大鼠心肌细胞DNA的PCR检测 转染pLX(hIL-10)SN大鼠心肌细胞提取DNA作PCR，扩增产物在1.5%琼脂糖电泳分析显示转染pLX(hIL-10)载体的有特异性扩增的pLXSN(1 511 bp)至hIL-10 cDNA(546 bp)的片段，为679 bp，而转染空白载体pLXSN的大鼠心肌细胞则没有。
2.2.2 转染大鼠心肌细胞mRNA的 RT-PCR检测 转染的大鼠心肌细胞总RNA作RT-PCR，扩增产物琼脂糖电泳分析显示转染载体pLX(hIL-10)SN有特异扩增的hIL-10 mRNA片段(418 bp)，而转染空白载体pLXSN的大鼠心肌细胞则没有。
2.2.3 目的基因hIL-10在大鼠心肌细胞表达的检测 ELISA检测显示hIL-10基因在pLX(hIL-10)SN转染大鼠心肌细胞48 h(day 2)后开始，达538 ng／(106 cells*24 h)，高峰在3 d，为1 755 ng／(106 cells*24 h)(见图3)。然后逐渐下降，56 d后未能检测到。
图3 ELISA检测HIL-10在大鼠心肌细胞的表达
Fig.3 hIL-10 expression in CMC detected by ELISA
Note:The detection shows that expression of exogenous hIL-10 gene begins after hIL-10 gene transfer 48 h［538 ng／(106cells*24 h)］ by retroviral vector pLX(hIL-10)SN. The expression level peak is at day 3［1 755 ng/(106cells*24 h), and then declines gradually［1 358 ng／(106cells*24 h), 1 057 ng／(106cells*24 h), 963 ng／(106cells*24 h),824 ng／(106cells*24 h) at day 4, day 7, day 14 and day 28 respectively］. It is not detectable after day 56
3 讨论
基因转移的研究不但用于基因治疗，还是其它分子生物学研究的有力工具。例如通过动物基因转移试验可了解有关基因组结构与表达的调控，动物生长发育与进化，以及人类原癌基因激活机理等。目的基因的转移方法中，物理，化学及融合法的转移效率较低，难以取得稳定表达的转化细胞是其应用受到限制的两个主要原因。虽出现颗粒轰击技术等
图4 pLXSN和重组载体pLX(hIL-10)SN的结构图
Fig.4 Map of pLXSN and recombinant vector pLX(hIL-10)SN
改造方法，还不能完全克服上述缺点。因而不得不求助于其他基因转移技术，病毒载体是其中之一。
逆转录载体是常用的基因转移系统，它具有很高的转染率，其感染分裂的靶细胞的效率可达100%［9］。pLXSN是双表达载体，其外源性目的基因由5′LTR中的调控序列启动控制，而选择性基因Neo基因由SV40增强启动子调控(见图4)。将人IX因子基因构建进pLXSN，通过包装细胞PA317包装获得对原不表达IX因子的人皮肤成纤维细胞的感染性，皮肤成纤维细胞从而变成IX因子的高分泌细胞，达到4.56 μg／(106 cells*24 h)［10］。
心肌细胞是人类基因治疗靶细胞的类型之一，对逆转录病毒载体的感染较为敏感。CMC在许多病理条件下既是靶细胞，又通过多种途径成为参与者，其中通过分泌TNF-α［11］，IL-1［12］，ICAM-1，活性氧［13］等是它的重要效应。而细胞因子的自分泌和旁分泌作用所导致的不断放大的炎症效应是许多心脏疾病持续发展和不断恶化的一个重要环节。因而打断这一环节有可能延缓甚至逆转疾病的发展进程。而IL-10具有重要的抗炎及免疫抑制作用。本研究构建表达hIL-10的逆转录病毒重组体PLX(hIL-10)SN并在大鼠心肌细胞稳定表达，从而为下一步探讨通过IL-10基因转移抑制心肌细胞的炎症反应，延缓或者逆转心肌疾病的发展，为最终在分子水平的早期临床试验提供了物质保证。
中山医科大学附属第一医院肾脏研究所，广州510080
作者简介：李锦华，男，33岁，硕士，主治医师，主要研究分子医学
4 参考文献
1 Howard M.Biological properties of IL-10. Immunol Today, 1992;13(6):198
2 De Waul, Malefyt R.Interleukin 10 (IL-10) and viral IL-10 strongly reduce antigen specific human T cell proliferation by diminishing the antigen-presenting capacity of monocytes via downregulation of class II major histocompatibility complex expression. J Exp Med, 1991;174(4):915
3 Chang C H, Furue M,Tamaki K.Selective regulation of ICAM-1 and major histocompatibility complex class l and ll molecular expression on epidermal Langerhans cells by some of the cytokines released by keratinocytes and T cells.Eur J Immunol ，1994；24:2889
4 Maureen Howard, Tony Muchamuel, Silvia Andrade. Interleukin 10 protects Mice from Lethal Endotoxemia.J Exp Med ,1993;177:1205
5 Enk Ah,Angeloni V L,Udey M C et al.lnhibition of Langerhans cell antigen-presenting function by IL-10 -α role for IL-10 in induction of tolerance. J Immunol，1993;151:2390
6 李锦华，陈永雄，刘 军 et al.表达人白细胞介素10的逆转录病毒载体的构建.现代临床医学生物工程学杂志，1998；4(2)：80
7 莎姆布鲁克 J，费里奇E F，曼尼阿蒂斯T著.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社，1992：24-56，325-332
8 王光武，王 凡.氢过氧化枯烯对心肌细胞DNA的影响.白求恩医科大学学报，1996；22(3)：226
9 Mulligan R C. The basic science of gene therapy. Science, 1993；260:926
10 Palmer, Thompson, Miller. Production of human factor IX in animals by genetically modified skin fibroblasts:potential therapy for hemophilia B.Blood, 1989；73(2)：438
11 Hosenpud J D, Campbell S M， Pan G.Indirect inhibition of myocyte RNA and protein synthesis by interleukin 1. J Mol Cell Cardiol， 1990;22(2):213
12 Weisensee D,Bereiter Hahn J,Schoeppe W et al.Effects of cytokines on the contractility of cultured cardiac myocytes. Int-J-Immunopharmacol,1993；15(5):581
13 Dachun Wang, Jeanie B McMillin, Roger Bick et al. Response of the neonatal rat cardiomyocyte in culture to energy depletion: effects of cytokines, nitric oxide, and heat shock proteins. Lab Invest，1996；75:809
〔收稿1998-02-01 修回1998-10-06〕