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创伤后巨噬细胞抑制T细胞功能的分子机制研究

中国免疫学杂志 1999年第8期第15卷分子与细胞免疫学

作者：梁华平　王正国　朱佩芳　罗艳　耿波　徐祥

单位：第三军医大学大坪医院野战外科研究所，重庆400042

关键词：创伤；巨噬细胞；T淋巴细胞

　　摘　要　目的：研究创伤后巨噬细胞抑制T细胞功能的分子机制。方法：将创伤小鼠的巨噬细胞，加入至正常小鼠T细胞培养系统中，测定T细胞功能及细胞内信使分子。结果：创伤后巨噬细胞在体外可明显抑制经ConA刺激的正常T淋巴细胞转化、白介素2(IL-2)的生成、IL-2受体α(IL-2α)的表达以及IL-2 mRNA、IL-2Rα mRNA水平，可升高正常活化T细胞内cAMP含量，降低cGMP含量、游离钙(［Ca²⁺］i)浓度及蛋白激酶C(PKC)活性。去除创伤小鼠脾细胞中的巨噬细胞，可不同程度地逆转T细胞功能的受抑状态，并降低cAMP含量，增加cGMP含量、［Ca²⁺］i浓度及PKC活性。结论：创伤后巨噬细胞可通过改变活化T细胞内信使分子水平，进而抑制T细胞功能。

　　中国图书分类号　R 640.3

Molecular mechanism of suppressive effect of macrophages from traumatized mice on T cell functions

LIANG Hua-Ping, WANG Zheng-Guo, ZHU Pei-Fang et al. Research Institute of Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042

　　Abstract　Objective:To study molecular mechanism of suppressive effect of macrophages from traumatized mice on T cell functions.Methods:Macrophages from traumatized mice were added into the culture system of normal T cells and then T cell functions and intracellular messenger molecules were determined.Results:Macrophages from traumatized mice could obviously suppress transformation of normal T lymphocyte stimulated with ConA, interleukin 2(IL-2) production, IL-2 receptor α(IL-2Rα) expression ,IL-2 mRNA and IL-2R mRNA levels, and could elevate cAMP contents of activated normal T cells while decreasing cGMP contents, free calcium(［Ca²⁺］i) concentration and protein kinase C(PKC) activity. Removal of macrophages from splenocytes of traumatized mice could at various degree reverse the suppression of T cell functions, decrease cAMP contents while increasing cGMP contents, ［Ca²⁺］i concentration and PKC activity.Conclusions:Macrophages from traumatized mice may suppress T cell functions via altering messenger molecule levels in activated T cells.

　　Key words　Trauma　Macrophage　T lymphocyte

　　严重创伤后巨噬细胞免疫抑制活性增强是导致T细胞功能受抑的重要原因之一。以往研究证实，创伤后巨噬细胞可通过分泌大量的PGE₂及直接的细胞接触方式发挥其对T淋巴细胞功能的抑制效应^［1，2］。但对其抑制T细胞功能的分子机制尚不清楚，本研究对此进行了探讨。

　　1　材料与方法

　　1.1　实验动物及致伤模型　Balb／c小鼠(本校动物所提供)，雌雄各半，6～8周龄，18～22 g。随机分为正常对照、伤后1、2、4、7、10 d共6组，每组10只动物。参照文献［2］制备小鼠双后肢闭合性创伤模型。

　　1.2　T淋巴细胞的分离与活化　按常规制备脾细胞悬液，采用尼龙毛柱法^［3］分离脾细胞中的T细胞。酸性α-醋酸萘酚酯酶(ANAE)染色法鉴定T细胞纯度＞92%，台盼蓝拒染试验证明分离出的T细胞活力＞95%。将T细胞以RPMI1640培养液(Gibco公司)调成5×10⁶ ml^-1，加入终浓度为10 μg/ml的ConA(Sigma公司)，于37℃、5%CO₂培养箱中孵育以活化T细胞。

　　1.3　活化T细胞指标测定

　　1.3.1　T淋巴细胞转化、IL-2活性、IL-2Rα测定　参照文献［4］进行。³H-TdR由中国科学院上海原子能研究所提供，IL-2标准品及CTLL₂细胞株由第三军医大学免疫教研室提供，大鼠抗小鼠IL-2Rα单克隆抗体由Boehringer Mannheim公司提供，FITC标记兔抗大鼠IgG单克隆抗体由华美生物工程公司提供。

　　1.3.2　IL-2 mRNA，IL-2Rα mRNA测定　T细胞经活化10 h后收集细胞，以异硫氰酸胍-苯酚-氯仿／异戊醇法提取细胞总RNA，参照文献［4，5］测定IL-2 mRNA及IL-2Rα mRNA水平。所用的cDNA探针包括：1.0 kb片段的IL-2 cDNA和0.92 kb片段的IL-2Rα cDNA(ATCC公司)。地高辛随机引物标记药盒由Boehringer Mannheim公司提供。

　　1.3.3　cAMP、cGMP含量、游离钙(［Ca²⁺］i)浓度、蛋白激酶C(PKC)活性测定　T细胞经活化2 h后收集细胞，参照文献［6-8］处理细胞并测定cAMP、cGMP含量、［Ca²⁺］i浓度及PKC活性。

　　1.4　各组巨噬细胞在体外对正常小鼠T细胞上述指标的影响　在正常T细胞活化培养的同时，加入各组巨噬细胞(占细胞总数10%)，测定各指标变化情况。

　　1.5　去除脾细胞中巨噬细胞对上述指标的影响　按常规制备脾细胞悬液，置于塑料平皿中，于培养箱中孵育2 h使巨噬细胞贴壁，收集非粘附细胞并调至原浓度，参照活化T细胞的方法，活化脾细胞及非粘附细胞，测定上述指标的变化。

　　1.6　统计学处理　结果以平均值±标准差(

　　2　结果

　　2.1　各组巨噬细胞在体外对正常小鼠T淋巴细胞转化的抑制作用　于正常小鼠T细胞培养系统中，加入正常对照组巨噬细胞，对T淋巴细胞转化具有轻微刺激作用，但加入创伤各组巨噬细胞，对T淋巴细胞转化具有不同程度的抑制作用，以伤后1、2、4 d 的抑制作用最为明显，伤后10 d尚未完全恢复至正常对照水平(表1)。

　　2.2　各组巨噬细胞在体外对正常小鼠T淋巴细胞功能的影响　与正常对照组相比，创伤4 d组巨噬细胞在体外对正常T淋巴细胞IL-2的生成、IL-2Rα表达以及IL-2 mRNA、IL-2Rα mRNA水平均具有明显的抑制作用(表2)。

　　2.3　各组巨噬细胞在体外对正常小鼠活化T细胞内信使分子的影响　和正常对照组相比，创伤4 d组巨噬细胞在体外可升高正常活化T细胞内cAMP含量，降低cGMP含量，提高cAMP／cGMP比值，并明显降低细胞内［Ca²⁺］i浓度及PKC活性(表3)。

　　2.4　去除脾细胞中的巨噬细胞对T细胞功能的影响　去除正常对照组小鼠脾细胞中的巨噬细胞，对脾细胞IL-2的生成、IL-2Rα的表达以及IL-2 mRNA、IL-2Rα mRNA水平均无明显影响。去除创伤后4 d组小鼠脾细胞中的巨噬细胞，则可使4项指标的水平明显升高，但并不能使之完全恢复至正常(表4)。

　　2.5　去除脾细胞中巨噬细胞后对活化脾细胞内信使分子的影响　去除正常对照组小鼠脾细胞中的巨噬细胞，对活化脾细胞内cAMP、cGMP含量，［Ca²⁺］i浓度及PKC活性无明显影响。去除创伤后4 d组小鼠脾细胞中的巨噬细胞，则可明显降低其cAMP含量、增加cGMP含量，升高细胞内［Ca²⁺］i浓度及PKC活性(表5)。

表1　各组巨噬细胞在体外对正常小鼠T淋巴细胞转化的抑制作用(

　　Tab.1　In vitro suppressive effects of macrophages from each group on T lymphocyte transformation of normal mice (

Groups	T lymphocyte transformation(cpm)	Suppressive rate(%)
Normal T cells	15 210±2 245	0
+MΦ of normal control	16 427±2 032	-8±4
+MΦ on day 1 posttrauma	12 016±1 648¹⁾	21±4
+MΦ on day 2 posttrauma	9 582±865²⁾	37±7
+MΦ on day 4 posttrauma	8 670±940²⁾	43±4
+MΦ on day 7 posttrauma	12 472±2 156	18±3
+MΦ on day 10 posttrauma	12 320±1 274	19±3

　　note:1)P＜0.05，2)P＜0.01 vs normal control
表2　各组巨噬细胞在体外对正常小鼠T淋巴细胞功能的影响(
　　Tab.2　In vitro effects of macrophages from each group on T lymphocyte functions of normal mice(

Groups IL-2(U／ml) IL-2Rα(%) IL-2 mRNA(%) IL-2Rα mRNA(%)

Normal T cells 67±11 59±9 100±9 10±11

+MΦ of normal control 71±10 58±7 109±8 110±12

+MΦ on day 4 posttrauma 45±7¹⁾ 36±5²⁾ 56±8²⁾ 59±7²⁾

　　note:1)P＜0.05，2)P＜0.01 vs normal control
表3　各组巨噬细胞在体外对正常小鼠活化T细胞内信使分子的影响(
　　Tab.3　In vitro effects of macrophages from each group on messenger molecules of activated T cells from normal mice (

Groups cAMP

　　(pmol／10⁷cell)
cGMP

　　(pmol/10⁷cell)
cAMP/cGMP ［Ca²⁺］i

　　(nmol/L)
PKC

　　［pmol/(mg*p*min)］

Normal T cells 23.3±3.3 20.8±3.1 1.1±0.2 237±33 158±27

+MΦ of normal control 22.8±3.5 21.2±2.4 1.1±0.3 289±38 156±21

+MΦ on day 4 posttrauma 30.1±4.7¹⁾ 15.0±2.1¹⁾ 2.0±0.2²⁾ 149±17²⁾ 101±16²⁾

　　note:1)P＜0.05，2)P＜0.01 vs normal control
表4　去除脾细胞中的巨噬细胞对T细胞功能的影响(
　　Tab.4　Effect of removal of macrophages from splenocytes on T cell functions (

Groups IL-2(U／ml) IL-2Rα(%) IL-2 mRNA(%) IL-2Rα mRNA(%)

Normal control: 　　　　

total splenocytes 52±8 64±13 100±11 100±13

removal of MΦ 48±7 63±10 93±9 91±8

Day 4 posttrauma: 　　　　

total splenocytes 22±7¹⁾ 37±8¹⁾ 56±8¹⁾ 52±9¹⁾

removal of MΦ 42±6³⁾ 58±6²⁾ 87±7²⁾ 92±7³⁾

　　note:1)P＜0.05 vs normal control；2)P＜0.05；3)P＜0.01 vs total splenocytes subgroup on 4 day posttrauma
表5　去除脾细胞中巨噬细胞后对活化脾细胞内信使分子的影响(
　　Tab.5　Effect of removal of macrophages from splenocytes on messenger molecules of activated splenocytes(

Groups cAMP

　　(pmol／10⁷cell)
cGMP

　　(pmol/10⁷cell)
cAMP/cGMP ［Ca²⁺］i

　　(nmol/L)
PKC

　　［pmol/(mg*p*min)］

Normal control: 　　　　　

total splenocytes 32.8±4.0 30.7±5.0 1.1±0.3 224±31 147±19

removal of MΦ 30.4±4.2 32.4±4.4 0.9±0.2 231±22 142±21

Day 4 posttrauma: 　　　　　

total splenocytes 39.7±4.7¹⁾ 16.1±3.5²⁾ 2.4±0.5¹⁾ 143±16²⁾ 101±21¹⁾

removal of MΦ 30.8±3.2³⁾ 28.9±3.0³⁾ 1.1±0.4⁴⁾ 207±27⁴⁾ 143±18³⁾

　　note:1)P＜0.05；2)P＜0.01 vs normal control；3)P＜0.05；4)P＜0.01 vs total splenocytes subgroup on 4 day posttrauma3　讨论

　　严重创伤可致机体的免疫功能紊乱，以T细胞介导的细胞免疫功能受抑制现象表现得尤为突出^［1］。而创伤后巨噬细胞抗原呈递功能减弱、抑制型亚群数目增多及抑制活性增强是导致T细胞功能降低的重要原因之一^［9］。本研究观察到，创伤小鼠巨噬细胞在体外对正常小鼠T淋巴细胞转化、IL-2的生成、IL-2Rα的表达以及IL-2 mRNA、IL-2α mRNA水平均具有明显的抑制作用，去除创伤小鼠脾细胞中的巨噬细胞，则可使T细胞功能得以不同程度的逆转。表明创伤后巨噬细胞确可抑制T细胞功能。这可能与创伤后巨噬细胞可分泌大量的免疫抑制成分(如PGE₂)和对T细胞具有直接的细胞-细胞接触免疫抑制作用有关^［1，2］。

　　cAMP、cGMP是发现较早的细胞内信使分子。对于免疫细胞而言，cAMP常介导免疫抑制效应。其对T细胞的作用主要表现为：抑制T细胞的活化与增殖；抑制IL-2的生成、IL-2Rα的表达以及活化T细胞对IL-2的反应性；降低IL-2 mRNA及IL-2Rα mRNA的水平。与cAMP相反，cGMP则有利于促进T淋巴细胞的功能^［5，10］。说明cAMP、cGMP含量及其比值的变化均可影响T淋巴细胞的功能。有证据表明，细胞内［Ca²⁺］i浓度增加、PKC活性增强是T细胞活化的必需事件^［10］，而T细胞的活化又导致IL-2的合成及IL-2R的表达，进而引起T细胞的克隆性增殖。可见活化T细胞内［Ca²⁺］i浓度及PKC活性的高低也可影响T细胞的功能。创伤后巨噬细胞对T细胞功能的抑制效应是否可通过调节T细胞内信使分子水平而介导?尚鲜见文献报道。本研究观察到，创伤后巨噬细胞在体外可升高正常活化T细胞内cAMP含量，降低cGMP含量，提高cAMP／cGMP比值，并明显降低细胞内［Ca²⁺］i浓度及PKC活性，去除创伤小鼠脾细胞中的巨噬细胞，则可明显降低其cAMP含量，增加cGMP含量，升高细胞内［Ca²⁺］i浓度及PKC活性。表明创伤后巨噬细胞可参与调节T细胞的活化过程，并改变活化T细胞内信使分子水平。这可能是创伤后巨噬细胞发挥对T细胞免疫抑制效应的重要分子机制之一。

　　已知创伤后巨噬细胞产生PGE₂的能力明显增强^［1，9］。而PGE₂可增加T细胞内cAMP含量，进而提高cAMP／cGMP比值^［5］。增高的cAMP又可干扰T细胞膜上磷脂酶C的活化及磷脂酰肌醇代谢，降低细胞内［Ca²⁺］i浓度及PKC活性，从而抑制T细胞的活化^［10］。推测创伤后巨噬细胞对T细胞活化过程中信使分子的调节作用可能与此有关。关于创伤后巨噬细胞调节T细胞功能的详细作用机理尚需深入研究。

　　国家自然科学基金资助项目(No.39170744)

　　作者简介：梁华平，男，32岁，医学博士，副研究员，主要从事创伤感染与免疫的研究；

　　王正国，男，62岁，中国工程院院士，主要研究创伤外科学

　　4　参考文献

　　1　Grbic J T, Mannick J A, Cough D B et al. The role of prostaglandin E₂ in immune suppression following injury. Ann Surg, 1991;214(3):253

　　2　梁华平，王正国，耿　波et al.创伤后巨噬细胞对T细胞白介素2及白介素2受体α基因表达的直接接触抑制作用.细胞生物学杂志，1995；17(2)：86

　　3　李绍康，沈瑞珍.用国产尼龙毛纤维分离小鼠T淋巴细胞及T细胞鉴定.上海免疫学杂志，1981；1(1)：10

　　4　Horgan A F, mendez M V, O'Riordain D S et al. Altered gene transcription after burn injury results in depressed T-lymphocyte activation. Ann Surg,1994;220(3):342

　　5　Anastassiou E D, Paliogianni F, Balow J P et al. Prostaglandin E₂ and other cyclic AMP-elevating agents modulate IL-2 and IL-2R gene expression at multiple levels. J Immunol,1992;148(9):2845

　　6　陈海鑫，李振甲.组织中cAMP，cGMP放免分析法的改进.生物化学与生物物理进展，1986；13(5)：28

　　7　Hoyt D B, Ozkan A N, Frevert J et al. Alteration in Ca²⁺ homeostasis by a trauma peptide. J Surg Res, 1991;51:477

　　8　Christiansen N O, Juhl H.Purification and properties of protein kinase C from bovine polymorphonuclear leukocytes. Biochem Biophys Acta, 1986;885:170

　　9　Miller-Graziano C L, Szabo G,Kodvs K et al. Alterations in posttrauma monocyte subpopulation: Role in septic shock syndrome. J Trauma,1990;30(S12):S86

　　10　Hadden J W. Transmembrane signals in the activation of T lymphocytes by mitogenic antigens. Immunol Today, 1988;9:235

〔收稿1997-05-12　修回1998-02-04〕

作者：风清扬 2009-2-21

Groups	IL-2(U／ml)	IL-2Rα(%)	IL-2 mRNA(%)	IL-2Rα mRNA(%)
Normal T cells	67±11	59±9	100±9	10±11
+MΦ of normal control	71±10	58±7	109±8	110±12
+MΦ on day 4 posttrauma	45±7¹⁾	36±5²⁾	56±8²⁾	59±7²⁾

Groups	cAMP 　　(pmol／10⁷cell)	cGMP 　　(pmol/10⁷cell)	cAMP/cGMP	［Ca²⁺］i 　　(nmol/L)	PKC 　　［pmol/(mgpmin)］
Normal T cells	23.3±3.3	20.8±3.1	1.1±0.2	237±33	158±27
+MΦ of normal control	22.8±3.5	21.2±2.4	1.1±0.3	289±38	156±21
+MΦ on day 4 posttrauma	30.1±4.7¹⁾	15.0±2.1¹⁾	2.0±0.2²⁾	149±17²⁾	101±16²⁾