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病毒激活巨噬细胞产生的一氧化氮与细胞毒的关系
中国免疫学杂志 1999年第8期第15卷 肿瘤免疫学
作者：白莲花 于春 刘倩 李娟 鲍秋莉 陈乃玲
单位：北京军区总医院全军肝病研究所，北京 100700
关键词：一氧化氮；新城鸡瘟病毒；细胞毒活性
摘 要 目的：确定新城鸡瘟病毒Losota系(NDV-L)能否诱导小鼠腹腔巨噬细胞(PEMφ)产生一氧化氮(NO)以及该NO与小鼠PEMφ介导的细胞毒作用是否有依赖关系。方法：采用Griess、FACS分析和噻唑蓝(MTT)方法。结果：NDV-L与PEMφ作用2 h后就可以稳定地吸附在PEMφ表面，吸附率达80%左右；收集NDV-L与PEMφ作用24 h上清，发现有NO的释放，释放量与阳性对照组(BCG-LPS-PEMφ上清)的释放量接近；采用MTT法测定NDV-L-PEMφ对H22肝癌细胞、P815肥大细胞瘤、Raji细胞和K562白血病细胞的细胞毒活性(效／靶比为20∶1)，发现NDV-L-PEMφ对这些靶细胞具有明显的杀伤活性，且该活性与NDV-L-PEMφ诱导NO之间有一定的依赖性。结论：新城鸡瘟病毒Losota(NDV-L)能诱导小鼠巨噬细胞产生和释放一氧化氮，且该一氧化氮与巨噬细胞的细胞毒活性具有依赖关系。
The study of relationship between Nitric Oxide(NO) and the cytotoxic activies of peritoneal elicited macrophage(PEM) induced by Newcastle Disease Virus losota strain(NDV-L)
BAI Lian-Hua, YU Chun, LIU Qian et al. Institute of Liver Disease, Beijing Army General Hospital，Beijing 100700
Abstract Objective:Determine if NDV-L can induce mouse PEMφ releasing Nitric Oxide (NO) and the relationship between the NO and the cytotoxic activity of PEMφ.Methods:Used Griess FACS and MTT analysis.Results:NDV-L could absorb steadily on the surface of PEMφ after infecting PEMφ for 2 h and absorption ratio was about 80 percent. When detecting the supernatant liquid which NDV-L infected PEMφ for 24 h found that the quantities of NO was almost equal to the positive control group (BCG-LPS-PEMφ); While using MTT assay also found that the cytotoxic activities of NDV-L-PEMφ against H22, P815, K562 and Raji targets was much higher than the ones of control group and there were some dependent relationship between NO and the cytotoxic activities of PEMφ.Conclusion:Newcastle Disease Virus can induce macrophages producing Nitric Oxide (NO) and there was relationship between the NO and the cytotoxic activities of PEMφ.
Key words Nitric Oxide Newcastle Disease Virus Cytotoxicity
巨噬细胞是一种非特异性的免疫细胞，激活以后可具有较强的杀伤活性。近年来将其作为抗原提呈细胞(Antigen presenting cells, APC)和过继转输的免疫活性细胞用于肿瘤生物治疗的研究颇为活跃［1］。一氧化氮(NO)是一种简单而不稳定的自由基，很多细胞均有合成NO的酶，但直到80年代人们才开始认识NO的生物学作用，尤其与巨噬细胞的活性有着密切关系［2］。新城鸡瘟病毒(Newcastle Disease Vius)具有对人不致病等优点，故用于肿瘤生物治疗的研究报道较多［3］。尤其最近我们发现用其亚系(NDV-L)可以激活小鼠腹腔巨噬细胞(Peritoneal Elicit macrophage, PEMφ)，产生TNF α和MHC限制性和MHC非限制性的细胞毒效应，这无疑为病毒应
1 材料与方法
1.1 病毒株 NDV-L的血凝效价(HAU 1∶1 280)，半数鸡胚感染量(EID50)为 10-8／0.2 ml，引自中国兽医监察所，由我室常规扩增定量。
1.2 肿瘤细胞株 H22为小鼠肝癌细胞系；P815为小鼠肥大细胞瘤；K562为人红白血病细胞系；Raji为人Burkit淋巴瘤细胞系；均引自大连医科大学肿瘤研究所。
1.3 主要药品与试剂 亚硝酸钠(北京刘李店化工厂)、对氨基苯磺酰胺(北京东四化学试剂商店)、双氢二乙胺(NED，北京芳草医药化工研制公司)、Griess试剂(1%对氨基苯磺酰胺和0.1% NED 1∶1混合，用前新鲜配制)、BCG(卡介苗，卫生部上海生物制品研究所)、LPS(细胞内毒素，和光纯药工业株式会社)、MTT(噻唑蓝，华美生物工程公司北京分公司)、羊抗兔-FITC抗体(军事医学科学院)、NG-单甲基-L-精氨酸(NO酶抑制剂，NG-MMA，邦定生物制品公司)。
1.4 动物 615纯系雌性小鼠，引自中国医学科学院实验动物中心。
1.5 小鼠腹腔巨噬细胞(PEMφ)的制备 参见文献［5］。取健康615系小鼠腹腔注射3%硫乙醇酸钠2 ml／只，3 d后用冷PBS冲洗腹腔收集细胞，离心破红细胞后用RPMI 1640使用液在37℃，5%CO2条件下培养4 h(调细胞浓度为1×107 ml-1)，即为PEMφ。
1.6 NDV-L对PEMφ感染性测定 将NDV-L(HAU 1∶1 280，EID50为 10-8/0.2 ml)与PEMφ(1×106 cells)于37℃，5%CO2条件下作用不同的时间(1、2、4、8、24、48 h)后，加兔抗NDV-L抗体(本室制备)于37℃，5%CO2条件下30 min，再加羊抗兔IgG-FITC抗体继续作用30 min进行FACS分析。
1.7 一氧化氮的诱导及含量测定
1.7.1 NDV-L诱导小鼠PEMφ释放NO 将小鼠PEMφ贴壁培养后用NDV-L感染2 h，洗去未感染病毒，在RPMI 1640使用液中继续培养24 h，收集上清贮存-30℃待测NO含量；将未与NDV-L作用的PEMφ上清作为阴性对照组；将2×106 U的BCG 1 ml与PEMφ先作用24 h，洗涤后再加LPS (10 μg/ml)同样培养条件下作用2 h上清作为阳性对照组。以(BCG-LPS-NO)表示。
1.7.2 NO含量测定 采用Griess方法。取96孔平底板一块，将亚硫酸钠标准液释释为320、160、80、40、20、10和5 μmol/L 7个浓度，加入96孔板，每份样品3个复孔；将待测样品上清和空白对照(只加蒸馏水)加入另起一行的96孔板中，所有样品均加0.1 ml，均为3个复孔；然后各孔加入Griess试剂0.1 ml，室温显色10 min后用酶联仪上570 nm波长测OD值，用计算和绘制标准曲线即可推算出NO含量。
1.8 不同效价NDV-L诱导不同小鼠PEMφ产生NO 将效价为1∶1 280的NDV-L稀释成不同浓度(EID5010-2～EID5010-9)，取0.2 ml分别与PEMφ(5×106个)作用2 h后，将未吸附的NDV-L洗掉后再以无血清RPMI 1640培养液培养24 h，收集上清用Griess方法测NO含量。
1.9 细胞毒活性测定 按文献［6］方法。以H22、P815、K562和Raji细胞为靶细胞(1×105 ml-1)，NDV-L-PEMφ和BCG-LPS-PEMφ作效应细胞(效／靶为20∶1)。效靶细胞作用24 h后加入MTT试剂，在595 nm波长下测OD值，按以下公式计算细胞毒活性：
2 结果
2.1 NDV-L吸附于小鼠PEMφ的表面，NDV-L与小鼠PEMφ作用不同时间后，FACS显示，NDV-L与PEMφ感染2 h后即可相对稳定地吸附在PEMφ表面，吸附率达80%左右；而未与NDV-L作用的PEMφ吸附率为零。其中NDV-L-PEMφ为实验组，PEMφ为阴性对照组，见图1。
图1 NDV-L与PEM不同作用时间的FACS分析(h)
Fig.1 The FACS analysis of PEM treated by NDV-L in different time(h)
2.2 NDV-L诱导PEMφ释放NO，用NDV-L与PEMφ作用24 h后，发现释放NO，且释放量不仅高于非NDV-L感染的PEMφ组，且与阳性对照组(BCG-LPS-PEMφ)的释放量相当，见表1。
2.3 不同剂量NDV-L诱导小鼠PEMφ产生NO的分析：将不同浓度的NDV-L与PEMφ作用24 h后，发现PEMφ释放NO量随着NDV-L滴度的增高而增高，但在EID50为10-6～10-9／0.2 ml时，PEMφ分泌量维持在一个稳定水平(见表2)。
表1 NDV-L诱导小鼠PEM产生NO
Tab.1 The NO of PEM produced with NDV-L
| Groups | PEMφ | NDV-L | BCG | LPS | NO
(μmol/L) |
||
| (EID5010-8) | (ml) | ||||||
| PEMφ | 5×106 | — | 10 | ||||
| NDV-L-PEMφ | 5×106 | 0.2 ml | 501) | ||||
| BCG-LPS-PEMφ | 5×106 | — | 5×106 U | 10 μg | 561) | ||
note:1)P＜0.05
表2 不同剂量NDV-L诱导小鼠PEM产生NO
Tab.2 The NO of PEM produced with different doses of NDV-L
| PEMφ
(Dosage) |
Dose of NDV-L
EID50／0.2 ml |
Content of NO
(μmol/L) |
| 5×10-6 | 10-2 | 10 |
| 5×10-6 | 10-3 | 8 |
| 5×10-6 | 10-4 | 22 |
| 5×10-6 | 10-5 | 39 |
| 5×10-6 | 10-6 | 56 |
| 5×10-6 | 10-7 | 49 |
| 5×10-6 | 10-8 | 53 |
| 5×10-6 | 10-9 | 51 |
2.4 NG-MMA对PEMφ细胞毒活性与NO释放量依赖关系的影响 以H22、P815、K562和Raji细胞，采用MTT法测细胞毒，发现NDV-L-PEMφ组(NDV-L-PEMφ)的细胞毒活性明显强于非NDV-L感染的PEMφ组(PEMφ)，并与阳性对照组(BCG-LPS-PEMφ)结果相近；当在NDV-L-PEMφ组中加入NG-MMA时，发现除对K562的杀伤效应略有下降外，其余各瘤系(H22、P815、Raji)均有明显下降(见图2)。
图2 NDV-L-PEM对不同靶细胞的杀伤效应
Fig.2 The cytotoxicity of NDV-L-PEM to different target cells
3 讨论
巨噬细胞可以受多种细胞因子的诱导产生一氧化氮［7］，我们也曾证明巨噬细胞可以被NDV-L激活发挥细胞毒活性［5］。在本研究中发现NDV-L感染PEMφ 2 h后就可以稳定地吸附在其表面，并证明NDV-L与PEMφ作用24 h后即可诱导其分泌和释放NO，且与阳性对照组的分泌量相当。分泌量随着病毒滴度的增高(病毒含量下降)而增高，但达到一定滴度时(EID50为10-6～10-9/0.2 ml)，NO分泌量维持在一个稳定水平。这为NDV-L作为巨噬细胞的激活剂又提供了一个证据。本研究又以H22、P815、K562和Raji作为靶细胞研究的NO与PEMφ细胞毒活性之间的关系，发现NDV-L-PEMφ不仅对4种靶细胞具有明显的杀伤作用，且该细胞毒活性受到NG-MMA的调控。当在NDV-L-PEMφ组加入NG-MMA时发现NG-MMA显著地抑制了PEMφ对H22、P815和Raji 3种靶细胞的杀伤效应，而对K562的抑制效果不十分明显，这说明NG-MMA可能通过抑制NO含量间接抑制了PEMφ的细胞毒活性。究竟NO与PEMφ细胞毒之间的关系如何?NG-MMA通过何机制调控它们之间的关系还有待进一步研究。
本研究受全军“九五”攻关基金96D01资助
作者简介：白莲花，女，35岁，博士，副教授，主要从事肿瘤免疫学研究
用于肿瘤生物治疗开拓了新路［4］。但目前尚未见类似报道。本文有关上述的实验研究报道如下。
4 参考文献
1 Croft M, Dubey C. Accessory molecule and costimulation requirements for CD4 T cell response. Critical Reviews in Immunology， 1997;17:89
2 Cianciolo G, Hunter J, Silva J et al. Inhibitors of monocyte responses to chemotaxis are present in human cancerous effusions and react with monoclonal antibodies to be P15(E) structural protein of retroviruses. J Clin Invest, 1981;68:831
3 T Ahlert, Schirrmacher V. Isolation of a human melanoma adapted Newcastle disease virus mutant with highly selective replication patterns. Cancer Res, 1990;50:5962
4 白莲花，钱振超.新城鸡瘟病毒激活的小鼠腹腔巨噬细胞抗转移效应和机制的研究.上海免疫学杂志，1994；14(6)：334
5 Hamburg S I, Cassell G H, Rabinovitch M. Relationship between enhanced macrophage phagocyte activity and the induction of interferon by Newcastle disease virus in mice. J Immunology， 1980;124:1360
6 Huaizuan J, Weiming S, Ohe Y et al. Anew3-(4,5-dimethzlthhiazol-2-y1)-2,5-diphenzltetrazolium bromide(MTT) assay for testing macrophage cytotoxicity to L1210 and ist drug-resistant cell lines in vitro. Cancer Immunol Immunother, 1992;35:1360
7 郑永晨，杨贵贞.一氧化氮与吞噬细胞的免疫调节.国外医学*免疫学分册，1995；18(4)：204
〔收稿1997-08-11 修回1999-03-16〕