以Bacmid-杆状病毒-昆虫细胞系统表达人FGF-9①

以Bacmid-杆状病毒-昆虫细胞系统表达人FGF-9①

中国免疫学杂志 1999年第10期第15卷 分子与细胞免疫学

作者：李慧　魏刚　于永利

单位：魏刚　吉林省肿瘤医院，长春130012　李慧　于永利　白求恩医科大学免疫学教研室,长春 130021

关键词：FGF-9；表达；杆状病毒；昆虫细胞；转座子

　　摘　要　目的：在Bacmid-杆状病毒-昆虫细胞系统中表达人FGF-9。方法：采用RT-PCR技术，自新鲜人脑胶质瘤组织获取人FGF-9全编码区cDNA，将其克隆入pCR^TMⅡ质粒及pYEX4T-1真核表达质粒，经DNA自动测序仪进行DNA序列测定。将人FGF-9 cDNA定向克隆入pFastBac质粒,进一步将其转座入Bacmid中，在昆虫细胞Sf9中进行表达，采用SDS-PAGE对表达产物进行分析。结果：在昆虫细胞表达系统中表达出人FGF-9重组蛋白。结论：人FGF-9在Bacmid-杆状病毒-昆虫细胞系统中得到了表达。

　　中国图书分类号　R392.11

Expression of human fibroblast growth factor-9 in Bacmid-baculovirus

　　expression system

LI Hui, WEI Gang，YU Yong-Li.

　　Department of Immunology, Norman Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130021

　　Abstract　Objective: To express human fibroblast factor-9(hFGF-9). Methods: The full-length cDNA of hFGF-9 was isolated from human glioma by reverse transcription-PCR. The specific cDNA was cloned into pYEX4T-1 plasmid. The insert was confirmed by DNA sequencing , subcloned into pFastBac donor vector and transposed into Bacmid in DH10Bac. The recombinant Bacmid was used to transform Sf9 cells. The supernatant and cellular lysate were analyzed by using SDS-PAGE. Results: A specific protein in the cellular lysate of Sf9 containing hFGF-9 with MW 30 kD was found. Conclusion: hFGF-9 has been expressed in the Bacmid-baculovirus expression system.

　　Key words　Fibroblast growth factor-9　Expression　Baculovirus　Insect cells　Transposon

　　杆状病毒-昆虫细胞表达系统是一种真核细胞表达系统。该系统有许多优点：可在进行多种蛋白质的转录后加工修饰，表达水平极高，可达细胞蛋白的50% ；可表达非常大的基因；可同时表达多个外源基因；表达的蛋白质根据其本身的特性在昆虫细胞内外分布。这一表达系统自问世以来，人们对其进行了多方面的改进，使其不断完善。Bacmid-杆状病毒-昆虫细胞系统是一种新型杆状病毒-昆虫细胞表达系统。我们用这一系统进行了人FGF-9表达的尝试。

　　1　材料与方法

　　1.1　菌种和质粒　pYEX4T-1购自 CLONTECH Lab-oratories, INC, pFastBac和 DH10Bac购自GIBCO/BRL, pCR^TM Ⅱ质粒购自Invitrogen,菌种DH5α、INVaF由本

　　室保存。

　　1.2　酶和试剂　Trizol试剂购自GIBCO/BRL,引物经由上海生工合成，TaqDNA聚合酶、纯化质粒DNA所用的试剂盒(Wizard)、DNA回收试剂盒购自Promega公司, 逆转录酶、RNase、T4连接酶及限制性核酸内切酶购自大连宝泰克公司，TC-100购自GIBCO/BRL,新鲜人脑胶质瘤组织来自吉林省肿瘤医院。

　　1.3　PCR引物的设计及人FGF-9 cDNA片段的扩增　根据已发表的人FGF-9 cDNA序列^［1］,我们设计了一对PCR引物,上游引物：5'ACAA GAATTC ATGGCT CCCTTA GGTGAA G3';下游引物：5'TCGC GTCGAC TCAACT TTGGCT TAGAAT ATC-3'。上游引物5'端带有EcoRⅠ酶切点，下游引物3'端带有SalⅠ酶切点。采用常规RT-PCR技术获取特异性cDNA。

　　1.4　PCR产物的克隆及测序　将PCR产物克隆入pCR^TM Ⅱ质粒，详细方法见文献［2］。经蓝白筛选、酶切鉴定获得阳性克隆。pCR^TM Ⅱ重组质粒及 pYEX4T-1真核表达质粒经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切后，将释放出的片段次级克隆入pYEX4T-1真核表达质粒。经酶切鉴定出阳性克隆后，经宝泰克公司自动测序仪进行DNA序列测定。

　　1.5　重组Bacmid的制备　将pYEX4T-1 载体上人FGF-9 cDNA片段以EcoRⅠ和SalⅠ双酶切位点定向插入pFastBac供体质粒，在DH5α宿主菌内扩增，鉴定出阳性克隆后，将重组pFastBac供体质粒转入DH10Bac细胞，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素及IPTG的培养板上挑选白色菌落，重新划板进行鉴定。然后取阳性的白色菌落培养，裂解，提取重组 Bacmid。0.5%琼脂糖凝胶电泳,23 V 12 h。

　　1.6　人 FGF-9的表达　在含有10%FCS的TC-100 培养液中培养Sf9细胞。将生长状态良好的细胞移至24孔板，每孔细胞数约为 2.3×10⁵个细胞。室温放置 10 min，待细胞贴壁后，吸去培养液。每孔加入 1 ml溶液B(25 mmol/L Hepes, pH7.1,125 mmol/L CaCl₂,140 mmol/L NaCl) 和重组Bacmid 5 μg ,同时以未重组Bacmid (5 μg)和单纯细胞培养为阴性对照。27℃培养4 h后，加入 1 ml含10%FCS的TC-100培养液，在27℃孵箱中培养。根据病毒感染Sf9细胞状况，72 h后收集上清及细胞。离心后，对上清及细胞沉淀按常规方法进行SDS-PAGE。

　　2　结果

　　2.1　人FGF-9 cDNA的获取及序列测定　从人新鲜脑胶质瘤组织中以RT-PCR法获得特异性cDNA。扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，长度约为647 bp(见图1)。将PCR产物克隆入pCR^TM Ⅱ质粒，然后将目的片段次级克隆入pYEX4T-1真核表达质粒。重组pYEX4T-1质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后，用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆(见图2)。DNA测序的结果表明，扩增的cDNA片段确为人FGF-9全编码区cDNA，编码208个氨基酸（见图3）。

图1　琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物

　　Fig.1　Analysis of hFGF-9 specific RT-PCR products by agarose gel electrophoresis

　　Note:lane 1:PCR marker;lane 2:hFGF-9 specific cDNA product

图2　琼脂糖凝胶电泳分析重组pYEX4T-1质粒

　　Fig.2　Electrophoretic analysis of recombinant plasmid

　　Note:lane 1:PCR marker;lane 2:PCR product of hFGF-9;lane 3:the pYEX4T-1～hFGF-9 plasmid digested with EcoR I and Sal I

图3　人FGF-9 cDNA测序的部分结果

　　Fig.3　Part of cDNA sequencing of hFGF-9

　　2.2　人FGF-9在昆虫细胞（Sf9）中的表达　将人FGF-9 cDNA片段以EcoRⅠ和SalⅠ双酶切位点亚克隆至pFastBac供体质粒（重组质粒具有氨苄抗性），经双酶切及2％琼脂糖凝胶电泳鉴定出阳性克隆。用pFastBac供体质粒转染DH10Bac细胞（感受态细菌抗卡那霉素和四环素），提取重组Bacmid 。将提取物用0.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,取完整的Bacmid (＞135 kb)做PCR鉴定。未插入目的片段的pFastBac供体质粒转座后PCR产物长度是2 300 bp，重组Bacmid 的PCR产物长度为2 924 bp(见图4)。用转座成功的重组Bacmid 转染Sf9细胞，72 h后，收集上清为扩增重组的杆状病毒，用 100 μl收集的上清重新感染Sf9细胞（1×10⁶个），72 h后，收集上清。将上清做倍比稀释后再感染Sf9细胞，以确定杆状病毒滴度。用适量的病毒感染昆虫细胞，72 h后，取培养上清及细胞沉淀按常规方法进行SDS-PAGE。结果表明，重组杆状病毒感染的昆虫细胞表达1条对照细胞不表达的、分子量为30 kD左右的蛋白带。这与报道的人FGF-9的蛋白质分子量基本一致(见图5)。

图4　重组Bacmid的鉴定

　　Fig.4　Identification of recombinant Bacmid

　　Note:A.electrophoretic analysis of recombinant Bacmid;lane 1:λDNA/Hind Ⅲ marker;lane 2:the recombinant Bacmid;B. PCR verification of recombinant Bacmid;lane 1:PCR product;lane 2:λDNA/Hind Ⅲ marker

图5　表达产物的SDS-PAGE分析

　　Fig.5　The SDS-PAGE analysis of expressed proteins

　　Note:lane 1:protein markers;lane 2～4:the lysate of control;lane 5:the lysate of Sf9 cell containing recombinant Bacmid;lane 6:the supernatant of Sf9 cell containing recombinant Bacmid

　　3　讨论

　　苜蓿银纹夜蛾杆状病毒(AcNPV)是应用最为广泛的杆状病毒表达载体。AcNPV是环形双链DNA病毒，分子量为130 kb左右。具有感染性的病毒进入易感昆虫细胞6 h后开始复制。在感染早期，被感染细胞通过芽生方式释放胞外病毒颗粒(ECV)；在感染后期,细胞核内形成由病毒颗粒（OV）和多角体蛋白组成的包涵体，多角体蛋白含量最高可达整个昆虫细胞蛋白的50%。当昆虫细胞被裂解后,OV颗粒从胞内释放出来，包裹它的多角体蛋白可使病毒免受环境因素的灭活 。在体外培养条件下，多角体蛋白是病毒完成生活史的非必需成分。多角体基因的启动子具有极强的启动蛋白表达能力,常被用来构建杆状病毒转递质粒^［3］。

　　杆状病毒转递质粒构建的基本方法是：将多角体基因的启动子组装入质粒(如PUC质粒)， 在其下游插入多角蛋白基因的两端侧翼,再在两翼的中间加上多克隆位点(MCS)。将克隆入外源基因的转递质粒和野生型AcNPV共转染昆虫细胞。在昆虫细胞内,通过多角体蛋白基因两端侧翼同源区与AcNPV发生同源重组,而将外源基因整合到亲本病毒基因组的相应位置。发生了同源重组的杆状病毒由于多角体基因被破坏,不能在感染细胞中形成包涵体。人们根据这一特点, 在光学显微镜下挑选含重组杆状病毒的昆虫细胞。采用此种方法，获得的重组体的几率仅为0.1%～1.0%，且易得出假阳性结果。

　　为了提高重组率，Pharmingen公司推出了Baculo-Gold^TM系统。这一系统中提供的杆状病毒是经过了致死性删切的线性DNA，此 DNA不能复制出成熟的病毒颗粒。当带有外源基因的重组转递质粒与经过致死性删切的杆状病毒发生同源重组后，该病毒可被复活而感染昆虫细胞，因此，该系统使同源重组率在理论上达到100.0%^［4］。

　　本实验所采用的是利用转座原理构建的Bacmid-杆状病毒-昆虫细胞表达系统。pFastBac是供体质粒，组装有Tn7的左右两臂序列, 两臂之间为多角体蛋白基因的启动子，启动子下游依次是多克隆位点、SV40的 Poly(A)位点。pFastBac带有庆大霉素抗性基因 (Gen⁺ )。用克隆有外源基因的pFastBac转化DH10Bac细菌。DH10Bac细菌含辅助质粒和Bacmid。辅助质粒携有四环素抗性基因(Tet⁺)和编码转座酶的基因。Bacmid是一种杆状病毒穿梭载体(Baculovirus　shuttle　 vector),它包括卡那霉素抗性基因(Kan⁺)和复制子（mini-F）。复制子能使 Bacmid 在大肠杆菌中低拷贝的复制和稳定的分离。它还包括来源于pUC质粒的LacZα 肽段编码基因，在LacZα的N 末端是 Tn7转座子的靶位点（mini-attTn7）。Bacmid可在大肠杆菌DH10Bac中繁殖，转移卡那霉素抗性。含Bacmid的宿主菌在IPTG诱导下形成蓝色菌落。pFastBac中的外源基因在辅助质粒编码的转座酶的作用下，通过转座而插入Bacmid基因组中（见图6）。这一插入干扰了LacZα的的表达, 所以含有重组Bacmid的DH10Bac细菌在有IPTG的培养板上形成白色的菌落^［5］。 和以往用于外源基因表达的系统相比，Bacmid-杆状病毒-昆虫细胞系统具有以下的优点：节省时间，采用此系统，从外源基因开始转座至重组蛋白被表达只需7～10 d。节省人力，因为转座过程发生在大肠杆菌DH10Bac中，所以重组杆状病毒的筛选也是在大肠杆菌中进行，利用抗性标记进行筛选和利用PCR进行鉴定，把人们从繁琐的筛选工作中解放出来。节省财力，因为Bacmid是作为一种质粒在大肠杆菌中复制，所以它可以被不断的扩增以适应试验所需。综上所述，该系统是一种简便快速的真核细胞表达系统，我们的试验也证实了这一点。

图6　重组杆状病毒的产生过程

　　Fig.6　Generation of recombinant baculoviruses

　　Note:the gene of interest is cloned into pFastBac donor plasmid,and the recombinant plasmid is transformed into DH10Bac competent cells.The mini-Tn7 element on the pFastBac donor plasmid can transpose to the mini-attTn7 target site in the Bacmid in the presence of transposition proteins provided by the helper plasmid.High molecular weight mini-prep DNA is prepare from selected E.coli clones containing the recombinant Bacmid ,and this DNA is then used to transfect insect cells

　　资金项目：本课题受国家自然科学基金资助（39570179）

　　作者简介：李慧，女，28岁，分子免疫学硕士；于永利，男，教授，博士生导师，主要从事分子免疫学研究

　　参考文献

　　1　Miyamoto M, Naruo K, Seko C et al. Molecular cloning of a novel cytokine cDNA encoding the ninth member of the fibroblast growth factor family, which has a unique secretion property.J Biol Chem,1993;268:2857

　　2　于永利，麻彤辉，杨贵贞.TA克隆及双链DNA测序：介绍一种快速克隆及分析PCR产物的方法.中国免疫学杂志，1994;10(1):5

　　3　Smith G E, Fraser M J, Summers M D. Molecular engineering of the autographa california nuclear polyhedrosis virus genome:deletion mutations within the polyhedrin gene.J Virol,1983;46:584

　　4　Kitts P A, Possee R D. A method for producing recombinant baculovirus expression vectors at high frequency.Virology， 1993;314(5):810

　　5　Luckow V A, Lee S C, Barry G F. Effect generation of infections recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol,1993;67(8):4566

收稿1999-02-12　修回1999-07-06