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抑制性底物杂交(SSH)技术研究BXSB小鼠的差异表达基因
中国免疫学杂志 1999年第11期第15卷 分子与细胞免疫学
作者：李 莹 韩文玲 杨高云 宋朱声 张颖妹 狄春辉 邓鸿业 马大龙
单位：北京医科大学免疫学系，北京100083
关键词：系统性红斑狼疮；抑制性底物杂交；BXSB小鼠
中国图书分类号 R392.11
摘 要 目的：利用抑制性底物杂交技术(Suppression subtractive hybridization,SSH)，以BXSB狼疮小鼠为模型，研究系统性红斑狼疮(SLE)发病相关基因。方法：分离BXSB和C57-BL-6小鼠骨髓细胞，提取mRNA，反转录构建cDNA文库，利用SSH技术研究BXSB小鼠差异表达基因。结果：获得了12个阳性克隆，其中有3个克隆编码TCR、MHC Ⅱ类分子及逆转录病毒基因表达产物，均在BXSB狼疮小鼠高表达，表明其与系统性红斑狼疮发病有关；1个在BXSB狼疮小鼠高表达的基因可能为新的cDNA片段，已被GenBank收录，登记号码为AF093453。结论：TCR、MHC Ⅱ类分子及逆转录病毒基因表达产物与系统性红斑狼疮发病有关。
Isolation of the differentially expressed genes in the BXSB mouse model of systemic lupus erythematosus by SSH(Suppression subtractive hybridization)technique
LI Ying,HAN Wen-Ling,YANG Gao-Yun et al
Department of Immunology,Beijing Medical University,Beijing 100083
Abstract Objective：To isolate the differentially expressed genes in BXSB mouse.Methods:Separated bone marrow cells from the BXSB and C57-BL-6 mice,extracted the polyA+RNA,synthesized the dscDNA by reverse transcription,and identified the differentially expressed genes by SSH technique.Results:Twelve positive genes were isolated,three of them have been reported to be related to SLE,including TCR,MHC Ⅱ and retrovirus gene products.In addition, found one novel gene similar to the TCR gene,submitted it to GenBank,and accepted an accession number AF093453.Conclusion:TCR,MHC Ⅱ molecule and retrovirus gene products may play important role in the development of SLE.At the same time,other molecules may also be related to SLE.
Key words Systemic lupus erythematosus Suppression subtractive hybridization BXSB mouse
系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种侵犯多系统、多器官的自身免疫病。它的发病与遗传、病毒感染、环境等多种因素有关，遗传因素起更重要的作用，但目前对其发病相关基因的研究还比较少。小鼠SLE模型的出现，大大促进了对其发病机理的研究。BXSB小鼠是狼疮小鼠的一种，雄鼠发病早，与人类SLE有相似的免疫学异常和病理表现［1］。过继转移实验表明，BXSB小鼠发病的细胞学基础在于骨髓或脾脏中的造血干细胞，与细胞发育的微环境和体内的激素水平没有关系［2］。细胞转移及Y染色体转移实验表明：BXSB雄鼠Y染色体上的突变基因Yaa基因(Y chromosome-linked autoimmune accelerator)能够加速自身免疫病的发生。但Yaa基因本身并不能使遗传背景正常的小鼠发病，必须依赖于有自身免疫病发病倾向的小鼠体基因发生异常，即系统性红斑狼疮是一种多基因异常所致的遗传病［3］。我们以BXSB小鼠骨髓细胞为Tester,以 C57-BL-6小鼠骨髓细胞为Driver,利用抑制性底物杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)技术［4］，探讨SLE发病相关基因。
1 材料与方法
1.1 动物 BXSB雄鼠购自美国Jackson实验室，由免疫系动物室饲养。C57-BL-6雄鼠，由北京医科大学实验动物部提供。
1.2 细胞制备 取4周龄BXSB和C57-BL-6雄鼠，同时断颈处死，分别无菌取其骨髓，用pH7.2 Tris.NH4Cl溶解红细胞，制备骨髓细胞悬液，计数细胞，调整Tester、Driver细胞数一致，达到1×107ml-1。
1.3 细胞RNA的提取
1.3.1 总RNA的提取 采用GIBCO BRL公司的TRIzolTM 试剂，所用操作按试剂说明书进行。提取的总RNA溶于无RNase的水中，分光光度计(Backmen 640)定量后，用于点杂交。
1.3.2 细胞mRNA的提取 采用Pharmacia公司的Quick Prep Micro mRNA Purification kit，操作按试剂盒说明进行。提取的mRNA用于合成双链cDNA。
1.4 合成双链cDNA 采用Clontech公司的PCR-SelectTM cDNA Subtraction kit中的试剂和酶，按说明书操作。模板为上述Driver和Tester的mRNA。
1.5 SSH差异筛选 采用Clontech公司的PCR-SelectTM cDNA Subtraction kit。原理详见参考文献［4］。操作按说明书进行。将扩增产物经处理后连接到pGEM-T Easy载体中，转化XLI-Blue菌，筛选阳性克隆，用PEG沉淀的方法纯化质粒DNA，由皓嘉国际公司代为测序。
1.6 在GenBank中进行序列比较并登记新基因 将测序所得到的序列通过E-mail或http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov进行同源性比较，通过GenBank中的www.ncbi.nlm.nih.gov的Bankit功能进行新基因登记。
1.7 mRNA斑点杂交 将序列分析后显示可能与系统性红斑狼疮有关的基因的cDNA制成标记探针(采用Dupont NEN NEL 803试剂盒)；用Tester和Driver的总RNA进行点杂交分析，尼龙膜为Dupont产品，具体方法参照说明书和分子克隆［5］。
2 结果
2.1 SSH结果 如图1所示：可见随着杂交过程的进行，Tester和Driver中共同条带大部分消失，部分条带加强，这些可能是Tester特异表达或高表达的基因。
图1 利用SSH技术研究BXSB小鼠差异表达基因片段的电泳结果
Fig.1 Electrophoretic analysis of result of study on differential expressed gene fragments of BXSB mouse using SSH technique
Note：1.DNA molecular weight marker；2.PCR amplification products after cDNA of BXSB mouse was ligated with adapter-1 and adapter-2；3.PCR amplification products after SSH hybridization
2.2 测序和同源性比较结果 将所得序列通过E-mail或www.ncbi.nlm.nih.gov进行同源性分析，结果如表1。
表1 利用SSH技术研究BXSB小鼠差异表达基因
Tab.1 Differential expressed genes of BXSB mouse studied by SSH method
| Clone | Length of
DNA fragment |
Homogenecity
(%) |
Homogeneous sequence | Result of
hybridization |
| B1 | 262 | 97 | Mouse protein with transformation activity | NH |
| SB21) | 590 | 94(408/452) | Mouse T cell receptor α | H |
| B3 | 465 | 99 | Mouse T cell receptor β | H |
| B4 | 295 | 97 | Mouse MT transferon | ND |
| B5 | same as B4 | ND | ||
| B6 | 296 | 98 | Mouse derma-derived cDNA | ND |
| B7 | 336 | 99 | Mouse KIF protein | NH |
| B8 | 260 | 97 | Mouse capsid-protein of reversetranscript virus | H |
| B9 | 269 | 98 | Mouse tyrosine protein kinase | NH |
| B10 | 396 | 98 | Mouse MHC IA-α chain | H |
| B11 | 321 | 99 | cDNA 3' terminus of mouse DPC blastocyst | ND |
| B12 | 203 | 96 | Gene of mouse IgG V section | NH |
note：1)new gene;H,high expression;NH,non-high expression;ND,no detection
图2 SB2核酸序列
Fig.2 DNA sequence of SB2
图3 狭缝杂交方法分析差异基因克隆B2、B3、B8和B10
Fig.3 Analysis of differential expressed genes B2，B3，B8 and B10 by slot hybridization
其中2号克隆590 bp中452与GenBank中鼠T细胞受体α基因部分区域有较高同源性，但并非完全等同，并且在EST数据库中无高同源性的序列，可认为是新的EST片段。该基因被命名为SB2，在GenBank中申请的登录号为AF093453，序列见图2。
2.3 RNA点杂交结果 通过点杂交的方法检测了8个片段在BXSB和C57-BL-6小鼠骨髓细胞mRNA的表达水平，其中4个为高表达或特异性表达，结果如图3所示。
3 讨论
SSH技术是建立在抑制性PCR技术上的一种新的减数杂交方法，能快速得到表达差异基因，对研究自身免疫有重要用途［4］，考虑到BXSB小鼠的发病与造血细胞有关，我们以小鼠骨髓细胞为材料，研究了对BXSB小鼠发病可能起作用的基因。我们的结果表明，在BXSB小鼠的骨髓细胞中，有一些已知的与自身免疫病有关的基因是高表达的，如MHC Ⅱ类分子、TCR和逆转录病毒样衣壳蛋白等，同时，我们利用cDNA-RDA技术也发现逆转录病毒样衣壳蛋白在BXSB小鼠骨髓细胞中高表达(待发表资料)，其可能的致病机理在于：逆转录病毒基因表达产物与自身细胞成份有相同的抗原决定簇，或者充当超抗原，引起自身免疫应答，导致自身免疫病的发生［6］。
已有实验证明，在NZBXW小鼠中，MHC Ⅱ类分子能促进自身免疫病的发生，且疾病的发生可被抗体所阻断［7］。本实验首次用SSH技术证明了MHC Ⅱ类分子在BXSB小鼠的发病中起一定的作用，影响了T细胞的分化，产生有害的自身反应性T细胞库，最终导致疾病的发生。BXSB小鼠骨髓细胞TCR β 基因表达水平增高。文献报道，NZBXW小鼠在致病性自身抗体的产生过程中需要T细胞的协助［8］，在BXSB小鼠中，也存在T细胞表型及功能的异常，是MHC Ⅱ类分子影响T细胞阳性选择的结果，除已知基因外，我们发现另外一个新的与TCR有高度同源性的cDNA片段表达水平明显增加，其生理和病理意义研究是值得探讨的课题。
作者简介：李 莹，女，29岁，分子免疫学专业博士；指导教师，马大龙，男，教授，博士生导师，主要研究分子免疫学
4 参考文献
1 Theofilopoulos A N,Dixon F J.Murine models of systemic lupus erythematosus. Adv Immunol, 1985;37:269
2 Kunisuke H,Robert A.Marrow transplantation from tolerant donors to treat and prevent autoimmune diseases in BXSB mice.Proc Natl Acad Sci,1988;85:2235
3 Murphy E D,Roths J B. A Y chromosome-associated factor in strain BXSB producing accelerated autoimmunity and lymphoproliferation.Arthritis Rheum,1979;22(11):1188
4 Diatchenko L, Lau Y F,Campbell A P et al.Suppression subtractive hybridization:a method for generating differentially regulated of tissue-specific cDNA probes and libraries.Pro Natl Acad Sci USA,1996;93:6025
5 Sambrook J,Fritsch E F , Maniatis T.Molecular cloning：a laboratory manual.2nd ed.New York:Cold spring harbor laboratory press, 1989：372-373
6 Skigawal I,Ogasawara H,Kaneko H et al.Systemic lupus erythematosus (SLE) and retrovirus.Nippon Rinslho,1997;55(6):1492
7 Hirose S,Nagasawa R,Sekikawa R et al.Enhancing effect of H-2-linked NZW gene on the autoimmune traits of (NZBxNZW)F1 mice.J Exp Med,1983;158:228
8 Hirose S,Tokushige K,Nozawa S et al.Contribution of the gene linked to the T cell receptor β chain gene complex of NZW mice to the autoimmunity of(NZBxNZW)F1 mice.Eur J Immunol,1991;21:823
收稿1999-02-09 修回1999-06-21