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狼疮性BXSB小鼠抗DNA抗体水平的动态变化
免疫学杂志 2000年第1期第16卷 基础免疫学
作者：徐志伟 邓鸿业 邓玉兰 丁桂凤
单位：徐志伟(北京医科大学免疫学系，北京 100083)； 邓鸿业(北京医科大学免疫学系，北京 100083)； 邓玉兰(北京医科大学免疫学系，北京 100083)； 丁桂凤(北京医科大学免疫学系，北京 100083)
关键词：狼疮性小鼠；抗DNA抗体；血尿素氮；尿蛋白质
摘 要：目的 探讨系统性红斑狼疮性小鼠抗DNA抗体水平的动态变化与疾病严重程度之间的关系。方法 测定了不同月龄的狼疮性BXSB小鼠的各种抗DNA抗体，血尿素氮和尿蛋白质浓度。结果 BXSB小鼠抗DNA抗体量的动态变化无规律性，但血尿素氮和尿蛋白质的浓度随鼠龄的增加而逐步升高。结论 抗DNA抗体水平并不与BXSB小鼠疾病的严重程度相平行，提示在诊断SLE或判断其严重程度时应测定多项实验指标为宜。
中图分类号：R392.12 文献标识码：A
Kinetics of anti-DNA antibody appearance
in lupus-prone BXSB mice
XU Zhi-wei DENG Hong-ye DENG Yu-lan DING Gui-feng
(Department of Immunology，Beijing Medical University，Beijing 100083，China)
Abstract：Objective It remains unknown whether there is a correlation between the level of anti-DNA antibodies and pathological severity in SLE mice．Methods Anti-DNA IgG and IgM antibodies， blood BUN and urine protein in lupus-prone BXSB mice with age varying from 1 to 6 month were detected quantitatively in our experiment．Results We found that anti-DNA antibodies in serum varied irregularly while the concentration of blood BUN and urine protein increased gradually with age．Conclusion That the level of anti-DNA antibodies do not parallel the pathological severity in BXSB mice and it be necessary to survey multiple different items for diagnosing SLE or determining its seriousness．
Key words：lupus-prone mouse； anti-DNA antibody； blood BUN；urine protein▲
系统性红斑狼疮(SLE)是典型的自身免疫复合性疾病。患者的血清中含有多种自身抗体，一般认为抗双链DNA(dsDNA)抗体是SLE的特异性标志［1］。但是，小鼠SLE发病过程中抗DNA抗体水平的动态变化与疾病严重程度的关系还缺乏系统的研究。我们以SLE模型之一的BXSB小鼠为对象，测定了1～6月龄雌鼠和雄鼠血清中IgM和IgG类型的抗dsDNA抗体和抗单链DNA(ssDNA)抗体的水平，同时测定血尿素氮和尿蛋白质的浓度，以探讨抗DNA抗体量的动态变化与肾病变之间的关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物 BXSB小鼠由北医大三院陈学荣教授自美国JACKSON实验室引进，本室饲养繁殖。
1.2 主要试剂 小牛胸腺DNA(CTDNA)，华美公司；S1核酸酶，Promega公司；生物素化羊抗小鼠IgG、IgM，Sigma公司；碱性磷酸酶标记的链霉亲合素，Vector公司；酶标板，NUNC公司；2500型酶标仪，BIORAD公司。
1.3 抗DNA抗体的测定
1.3.1 DNA抗原的预处理：CTDNA经酚∶氯仿∶异丙醇纯化，乙醇沉淀［2］。沉淀的DNA溶于含1mmol ZnCl2，0．06mol NaCl，0．1mol乙酸钠，pH5．0的溶液中，加S1核酸酶(100U／mgDNA)，37°C作用45min，水解单链DNA。加入终浓度10mmol的EDTA-Na2终止反应［3］，同上法提纯沉淀的DNA即为dsDNA。将纯化的DNA煮沸15min，迅速放冰浴中冷却变性，即得ssDNA。
1.3.2 ELISA法测定抗DNA抗体：用PBS将dsDNA和ssDNA配成50μg／ml浓度，加在新的96孔酶标板上，每孔0.2ml，室温下过夜。弃去孔内液体，加0．25ml含10％NBS的Hepes-NaCl(Hepes0.01mol，NaC1 0.14mol，pH7．4)液，37°C封闭1h。用含0．05％Tween 20的Hepes-NaCl液洗涤(下同)。每孔加1∶50稀释的小鼠血清0．2ml，37°C作用1h(下同)，洗涤。每孔加1∶2 000稀释的生物素化羊抗小鼠IgG和IgM液0．2ml。然后，每孔加1∶2 000稀释的碱性磷酸酶标记的链霉亲合素液0．2ml。最后加硝基苯磷酸钠(NPP)底物液0．2ml，显色。用酶标仪在405nm波长处读取光密度值(A405nm)。对照孔不加DNA，加1∶50稀释的正常C57小鼠血清，其余过程同上，用于校正零点。
1.3 血清尿素氮(BUN)浓度的测定 BUN测定试剂盒购自北京北化精细化学品公司临床诊断试剂分厂。测定方法按说明书进行。
1.4 尿蛋白质浓度的测定 按照文献［4］介绍的考马斯亮蓝法进行。
2 结果
2.1 抗dsDNA抗体水平 实验测定了1～6月龄雄性和雌性BXSB小鼠血清中IgM和IgG类型的抗dsDNA抗体的水平，结果见图1。
图 1BXSB小鼠血清(1∶50稀释)中IgM(Ⅰ)和IgG(Ⅱ)类型抗dsDNA抗体的水平
Fig 1Anti-dsDNA antibodies of IgM(Ⅰ) and IgG(Ⅱ) in BXSB mouse serum (1∶50 dilution)(n＝5)
2.2 抗ssDNA抗体水平 实验同时测定了1～6月龄雄性和雌性BXSB小鼠血清中IgM和IgG类型抗ssDNA抗体的水平，结果见图2。
图2 BXSB小鼠血清(1∶50稀释)中IgM(Ⅰ)和IgG(Ⅱ)类型抗ssDNA抗体的水平
Fig2 Anti-ssDNA antibodies of IgM(Ⅰ) and IgG(Ⅱ) in BXSB mouse serum (1∶50 dilution)(n＝5)
2.3 尿蛋白质浓度 实验结果显示，3月龄的雄性BXSB小鼠的尿蛋白浓度开始增加，并且鼠龄愈长，尿蛋白浓度愈加升高。而1～6月龄的雌性BXSB的尿蛋白浓度处于正常范围内(见图3)。
图3 BXSB小鼠尿蛋白质浓度
Fig3 Level of urine protein in BXSB mice(n＝5)
2.4 血清BUN浓度 实验结果表明：只有6月龄的雄性BXSB小鼠血清BUN浓度显著升高，而1～5月龄的雄性BXSB小鼠和1～6月龄的雌性BXSB小鼠的血清BUN浓度无明显差异(见图4)。
图4 BXSB小鼠血清尿素氮浓度
Fig4 Level of serum BUN in BXSB mice(n＝5)
3 讨论
BXSB小鼠的SLE发病有其独特性。由于Y染色体上携带有Yaa基因(Ychromosome linked autoimmune acceleration)加速自身免疫反应使得雄鼠较雌鼠发病早且严重。达5个月龄时，雄鼠约有半数死亡［5］。
实验结果显示1～6月龄雌雄BXSB小鼠IgM类型的抗dsDNA抗体水平相当，且无明显的上下波动；虽然IgM类型抗ssDNA抗体水平相近，但随着鼠龄的增加有下降的趋势。可能是随着BXSB小鼠SLE的发展，IgM类型的自身抗体在向IgG类型转换。总体上讲雄性BXSB小鼠IgG类型的抗dsDNA，ssDNA抗体水平高于雌性小鼠，此现象可能与雄鼠的发病特点有关，因为IgG类型的自身抗体具有较强的致肾炎作用［6］。但是，IgG类型的抗dsDNA，ssDNA抗体水平并没有随鼠龄的增加而升高。不过，也不能排除BXSB小鼠体内产生的大量的IgG类型抗DNA抗体以免疫复合物的形式沉积于肾脏的可能性。我们曾经检测到2月龄雄性BXSB小鼠肾脏已有IgG类免疫复合物的沉积，但同龄的雌性BXSB无此变化。
尿蛋白质浓度是反映肾炎的指标之一。图3显示雌性BXSB小鼠尿蛋白质浓度在1～6月龄之间基本处于较低水平状态。而雄性BXSB小鼠尿蛋白质浓度从3月龄开始高于雌性鼠，并随鼠龄的增加而逐步升高，提示肾炎病变不断加重。图4显示作为肾功能指标之一的血BUN水平在1～4月龄雌雄鼠之间无明显差别。从5月龄开始，雄鼠血BUN水平急剧升高，提示在肾炎之后出现肾功能障碍。相反，雌性BXSB小鼠无明显升高。
实验结果表明：发病的SLE小鼠的IgM和IgG类型抗dsDNA、ssDNA抗体水平与尿蛋白质和血尿素氮浓度之间无明显相关性，单纯测定抗DNA抗体水平并不能完全反映疾病的严重程度。由此提示在诊断SLE或判断其发病程度时应测定多项实验指标，综合分析才能得出较为客观的结论。
此外，在测定抗dsDNA抗体时用S1核酸酶处理DNA以去掉可能存在的单链DNA或单链DNA缺口。实验中还发现将dsDNA直接包被于新的NUNC酶标板上能得到较准确的结果。而用硫酸鱼精蛋白、甲基化小牛血清白蛋白以及多聚赖氨酸间接吸附了dsDNA和不吸附dsDNA时测得同份血清的OD值相同，并没有显示出结合抗dsDNA的抗体水平，此与文献报道［7］的相符。因此，在测定抗dsDNA抗体时应引起注意。■
基金项目：高校博士点专项科研基金资助项目，教技发中心［1999］26号
作者简介：徐志伟(1964-)，男，博士生，主要从事自身免疫病的分子机理研究。
参考文献：
［1］MOHAN C，DATTA SK．Lupus：Key pathogenic mechanisms and contributing factors［J］．Clin Immunol Immunopathol，1995，77：209～220．
［2］J 萨姆布鲁克，EF傅里奇才，T曼尼阿蒂斯，等.金冬雁等译.分子克隆［M］．第2版.北京：科学出版社，1992．954～956．
［3］MADAIO MP，HODDER S，SCHWARTZ RS，et al．Responsiveness of autoimmune and normal mice to nucleic acid antigens［J］．J Immunol，1984，132：872～876．
［4］李影林.中华医学检验全书(上册)［M］．北京：人民卫生出版社，1996．466～467．
［5］THEOFILOPOULOS AN，DIXON FJ．Murine models of systemic lupus erythematosus［J］． Adv Immunol， 1985，37：269～390．
［6］IZUI S，IWAMOTO M，FOSSATI L，et al． The Yaa gene model of systemic lupus erythematosus［J］．Immunol Rev，1995，144：137～154．
［7］KROUBOUZOS G，TOSCA A，KONSTADOVL-AKIS MM， et al． Poly-L-lysine causes false positive results in ELISA methods detecting anti-DNA antibodies［J］．J Immunol methods，1992，148：261～263．
收稿日期：1999-06-02；
修回日期：1999-10-20