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从半合成噬菌体抗体库中筛选抗角蛋白人抗体①
中国免疫学杂志 2000年第1期第16卷 分子与细胞免疫学
作者：王刚 化冰 王琰 刘玉峰
单位：王 刚(解放军海军总医院 北京 100037)；化 冰(解放军海军总医院 北京 100037)；王 琰(解放军海军总医院 北京 100037)；刘玉峰(第四军医大学西京医院 西安 710032)
关键词：噬菌体抗体库；角蛋白；人单克隆抗体
摘 要：目的：从半合成噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白抗体并进行鉴定。方法：以表皮角蛋白为抗原，通过吸附-洗脱-扩增过程从半合成噬菌体抗体库中筛选特异性抗角蛋白抗体，对其抗原结合活性和序列进行分析鉴定。结果：经过4轮筛选，获得20个能与角蛋白结合的阳性克隆，其中可产生特异性抗角蛋白抗体的克隆18个。经DNA指纹分析，判断所获克隆分别包含4个不同的Fab段基因。经切除基因Ⅲ后1个克隆表达出可与角蛋白特异性结合的可溶性Fab，序列分析表明其Vκ和VH分别属于Vκ1亚群和VH1亚群，VH CDR3序列符合半合成抗体库构建时的引物设计。结论：利用噬菌体抗体库技术可以不经免疫制备出高特异性的人源性抗角蛋白抗体。
分类号：R392.11
Cloning of human anti-keratin antibodies from semisynthetic phage antibody library
WANG Gang
Navy General Hospital,Beijing 100037
HUA Bing
Navy General Hospital,Beijing 100037
WANG Yan
Navy General Hospital,Beijing 100037
Abstract：Objective:To clone human anti-keratin antibodies from semisynthetic phage antibody library.Methods:Panning of semisynthetic phage antibody library against human epidermal keratin was conducted to select specific antibodies.The antigen binding activity and DNA sequence were determined and analyzed.Results:After 4 rounds of panning,20 positive clones were obtained and 18 clones were found to be able to bind keratin antigen specifically.DNA fingerprinting of the 18 clones showed 4 different digestion patterns representing 4 different positive clones.One of them could express soluble anti-keratin Fab antibody after removing the gene III fragment.DNA sequence analyses showed the Vκ and VH belonged to human Vκ1 subgroup and VH1 subgroup respectively.Conclusion:It is feasible to isolate human anti-keratin antibodies by-passing immunization using phage antibody library.
Key words：Phage antibody library Keratin Human antibodies▲
人体内天然存在的抗角蛋白自身抗体(Ak auto Ab)是维持机体免疫状态平衡的重要成员。在一些病理情况下(如银屑病、接触性皮炎等)Ak auto Ab的存在有利于限制病情的进展，对机体具有保护作用［1-3］。以往的研究发现，银屑病患者血清Ak auto Ab水平明显低于正常人，而输注高Ak auto Ab含量的人血丙种球蛋白收到了较好的疗效，并随着病情的好转，其血清Ak auto Ab也逐渐升高接近正常水平［4］。体外实验证明Ak auto Ab对培养角朊细胞的增生具有明显的抑制作用［5］，因此提示补充抗角蛋白抗体有可能成为银屑病等疾病新的治疗措施。由于鼠源单克隆抗体具有异源性，其在人体内的应用受到了限制，而人源性抗体的制备难度很大，抗体库技术的出现为人源抗体的制备提供了有效的手段，我们构建了一个半合成抗体库，可从中筛选人源特异性抗体［6］。本工作为深化对抗角蛋白抗体的认识，探讨制备人源性抗角蛋白抗体的方法并为今后进一步的治疗研究奠定基础，尝试从该半合成噬菌体抗体库中筛选抗角蛋白人抗体(HAKAB)。
1 材料与方法
1.1 半合成抗体库及其他主要试剂 半合成噬菌体抗体库为本室构建［6］；大肠杆菌菌株TG1、辅助病毒VCSM13为本室保存 ；各种内切酶均为Promega产品；人表皮角蛋白(5 mg/ml)和人血清IgG型抗角蛋白自身抗体(IgG-Ak auto Ab)为第四军医大学西京医院皮肤科制备。
1.2 抗角蛋白噬菌体抗体的筛选 以人表皮角蛋白为抗原，固相化至抗原管(Immuno-tube,Nunc)后参照文献［7，8］的方法对抗体库进行4轮筛选。每轮筛选均测定次级库滴度并计算噬菌体投入产出比(回收率)作为特异性噬菌体抗体富集的指标。
1.3 噬菌体抗体的制备及检测 在筛选的最后一轮，从TYE盘中分3批共挑取97个单集落制备噬菌体抗体。以1.25 μg/ml人表皮角蛋白包被ELISA板，经1%BSA封闭后加入待测噬菌体抗体上清(1∶1稀释)，以HRP-羊抗M13为二抗，孵育、洗涤后OPD底物显色；显色阳性的克隆再以人表皮角蛋白、人IgG、胃蛋白酶、HBsAg等为抗原同时包被ELISA板，鉴定其抗原抗体反应的特异性。
1.4 抗角蛋白可溶性Fab的表达及检测 参照文献［9］介绍的方法构建和表达可溶性Fab抗体。ELISA实验包被羊抗人Fab、人表皮角蛋白及无关抗原，以HRP-羊抗人Fab为二抗，分别检测上清中人Fab的表达、与角蛋白的结合活性及其特异性。
1.5 DNA序列 赛百胜公司测定。
2 结果
2.1 抗角蛋白噬菌体抗体的筛选 经过4轮筛选，噬菌体抗体回收率得到约20倍富集。从最后一轮挑取的97个单菌落制备噬菌体抗体，经ELISA检测有20个显示与角蛋白结合活性，其中18个与人IgG、胃蛋白酶、HBsAg等无关抗原不结合，具备特异性(18.6%)。表1为从中选取的3个代表克隆与各种抗原反应的结果。
表1 噬菌体抗体与角蛋白特异性结合的ELISA结果(A490，
Tab.1 ELISA results of phage antibodies against different Ags(A490，
Keratin
Pepsin
Papain
HBsAg
Clone 1
0.239±0.010
0.060±0.003
0.041±0.004
0.030±0.002
Clone 2
0.336±0.007
0.008±0.000
0.005±0.000
0.007±0.000
Clone 3
0.535±0.004
0.009±0.002
0.008±0.001
0.006±0.001
a-HBs1)
0.023±0.000
0.002±0.000
0.002±0.001
0.744±0.008
Note:1)a-HBs:anti-HbsAg phage antibody as control
2.2 抗体可变区基因的扩增及DNA指纹分析 18个特异阳性的?经PCR扩增，其中17个均扩增出κ链和重Fd链段 。扩增产物经CL-6B分子筛纯化后，以Hinf I酶切得到4种不同的酶切图形(见图1)，说明17个阳性菌落系来自4个不同的Fab基因克隆，其中1、11、12、13为1个克隆(克隆1)，2、3、5～10为1个克隆(克隆2)，4为1个克隆(克隆3)，14～17为1个克隆(克隆4)。
图1 阳性克隆可变区基因的Hinf I指纹图谱
Fig.1 Hinf I fingerprinting of the V genes of the positive clones
2.3 可溶性Fab抗体的表达 将4种阳性克隆质粒切除基因III，IPTG诱导表达可溶性Fab段。ELISA检测4种克隆的可溶性Fab表达，结果均表达出了人Fab段，以不同浓度人IgG的ELISA读数绘制标准曲线，计算各克隆表达Fab段的相对含量大约在100～1 000 ng/ml(表2)；再以ELISA检测Fab的抗原结合活性，发现仅克隆1表达了能与角蛋白抗原特异性结合的Fab抗体，另3个克隆所表达的Fab不能与角蛋白抗原结合(表2)，表中的阳性对照为从人外周血提取的多克隆抗角蛋白抗体，显示出与多种抗原的交叉反应。
表2 可溶性Fab抗体与角蛋白特异性结合的ELISA结果(A490，
Tab.2 ELISA results of soluble Fab against different Ags(A490，
Keratin
Pepsin
Papain
Ferritin
Clone 1
2.122±0.274
0.012±0.001
0.012±0.001
0.008±0.001
Clone 2
0.019±0.001
0.032±0.001
0.016±0.001
0.008±0.001
Clone 3
0.026±0.001
0.015±0.001
0.008±0.001
0.004±0.000
Clone 4
0.017±0.001
0.024±0.004
0.011±0.000
0.003±0.001
Pos
0.947±0.027
0.818±0.042
0.841±0.001
0.903±0.033
Neg
0.008±0.001
0.022±0.000
0.005±0.002
0.000±0.000
Note:Pos:IgG-Ak auto Ab as positive control;Neg:1%BSA-PBS as negative control2.4 可变区DNA序列测定 表达Fab段具有角蛋白结合活性的克隆1进行DNA序列测定(见图2)，结果表明其重链分别属于VH1、JH6，与人胚系VH基因有96%同源性；轻链为κ链，V和J分属Vκ1和Jκ2，与人胚系基因Vκ序列有92%的同源性。
图2 人抗角蛋白Fab的轻、重链可变区DNA及氨基酸序列
Fig.2 DNA and amino acid sequences of the human anti-keratin Vκ and VH
Note:The sequences underlined are CDRs
3 讨论
传统的杂交瘤技术是制备单克隆抗体的主要手段，但由于不能直接对人体进行免疫，制备人单抗的研究进展缓慢。而鼠单抗由于其异源性而限制了在人体内的应用，近年发展起来的噬菌体抗体库技术将人抗体基因克隆到噬菌体载体中，利用其表面呈现的特点可以方便地用不同的抗原筛选出相应的人源性抗体，为人单抗的制备提供了有效手段，尤其是通过构建大容量、具有良好多样性的抗体库，不经免疫制备人单抗，使抗体工程发展到了一个新阶段［9］。我们将人胚系VH基因段(含CDR1和CDR2)与人工合成的随机化CDR3在体外重组，再与人κ链库组合构建了半合成抗体库，并初步证明可从中不经免疫筛选到特异性人单抗［6］。为了进一步研究抗角蛋白抗体的特性，探讨人工制备HAKAB的方法，我们尝试从半合成噬菌体抗体库中筛选HAKAB，经4轮“吸附-洗脱-扩增”筛选和一系列鉴定，得到了4个克隆能与角蛋白特异结合的噬菌体抗体。当把这4个克隆表达为可溶性Fab分子后，只有1个克隆可与角蛋白特异结合，而另外3个克隆虽然有Fab分子的表达，但却失去了与角蛋白结合的活性。看来这3个克隆的Fab段只有表达在噬菌体的表面才能检测到与角蛋白的结合，其可能的原因有二：一是只有在表面表达时可与周围蛋白分子相互作用形成必要的立体构象；另一个可能是噬菌体抗体的检测更为敏感，因所用二抗为HRP-抗M13，可与噬菌体表面的蛋白结合，其中反蛋白VⅢ就有数千个拷贝，因此有很强的放大效应。而检测可溶性Fab时以HRP-抗人Fab为二抗，没有这么强的放大效应，因此当Fab与抗原结合的亲和力比较低时，仅能检测到表面表达的噬菌体抗体。
对成功表达人抗角蛋白Fab的克隆进行可变区基因序列分析，证明其重链CDR3区的特征与半合成抗体库CDR3的设计相吻合，其VH CDR3含有13个氨基酸残基，系引物CDR3-10的扩增产物［6］，相应随机氨基酸的编码序列符合NNK规律(N=A/C/T/G，K=G/T)。该抗体的制备成功进一步说明用半合成抗体库不经免疫而直接制备人抗体是切实可行的，同时也为今后研究人抗角蛋白抗体对角朊细胞的作用并探讨其临床应用前景奠定了基础。■
①国家自然科学基金(39670679)和军队医药卫生重点课题(96Z0004)资助项目
②通讯作者
作者简介：王 刚，男，35岁，博士生
参考文献：
［1］Liu Y F,Liu Y F,Zhang T S et al.Immunohistochemical study of anti-keratin autoantibodies in both normal and pathological states.J Chin Med,199
［2］Hintner H,Romani N,Stanzl U et al.Phagocytosis of keratin filamentaggregates following opsonization with IgG-anti-keratin filament autoantibodies.J Invest Dermatol,1987;88:176
［3］刘玉峰，刘彦仿，丁华野 et al.抗角蛋白自身抗体对接触过敏性皮炎的影响.中国皮肤性病学杂志，1992；6(1)：8
［4］李承新，刘玉峰，张泰山.人血丙种球蛋白治疗银屑病的近、远期效果观察及机理初探.第四军医大学学报，1996；17(5)：395
［5］王 刚，刘玉峰，刘彦仿.抗角蛋白自身抗体对培养角朊细胞代谢活性的影响.中华皮肤科杂志，1994；27(2)：94
［6］王 琰，化 冰，刘群英 et al.半合成抗体库的构建及鉴定.中华微生物学和免疫学杂志，1999；19(3)：238
［7］陈竞华，王 琰，刘群英 et al.人源性噬菌体抗体库的构建及HBsAg人单抗的筛选.中华微生物学和免疫学杂志，1995；15(3)：158
［8］Marks J D,Hoogenboom H R,Bonnert T P et al.By-passing immunization human antibodies from V-gene libraries displayed on phage.J Mol Biol,1991;222:581
［9］董志伟，王 琰主编.抗体工程.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997：243-244
收稿日期：1999-07-09