杂交瘤细胞核糖核酸抗病毒作用

杂交瘤细胞核糖核酸抗病毒作用

中国免疫学杂志 1999年第12期第15卷 肿瘤免疫学

作者：张涛　封江南

单位：卫生部武汉生物制品研究所免疫研究室，武汉430060

关键词：免疫核糖核酸发；杂交瘤；单克隆抗体；狂犬病毒

　　摘　要　目的：从分泌抗狂犬病毒糖蛋白单克隆抗体(IgM)杂交瘤细胞中提取核糖核酸，研究其抗狂犬病毒的作用。方法：腹腔注射该种核糖核酸4 w后用狂犬病毒CVS株进行颅腔攻击。结果：该核糖核酸能明显延长动物的生存时间。结论：该核糖核酸对狂犬病毒且有一定的抵抗作用。

　　中国图书分类号　R392.11

Effect of anti-virus of RNA from hybridoma cell

ZHANG Tao, FENG Jiang-Nan.

　　Wuhan Institute of Biological Products, Ministry of Public Health, Wuhan 430060

　　Abstract　Objective:To study the possibility of RNA extracted from hybridoma cell as RNA and the relation between this RNA and tranditional RNA. Methods:Extracting RNA from the hybridoma cell which secrets monoclonal antibody(IgM)against the G-protein of rabies virus and injecting these RNA into cranial cavity in four weeks.Results:The RNA extracted from hybridoma cell could delay the dying of mice obviously. Conclusion: The RNA extracted from hybridoma cell had the same function as the traditional immune RNA,wihch could provided a new nethod to study the mechanism of immune RNA.

　　Key words　Immune RNA (iRNA)　Hybridoma cell　Monoclonal antibody　Rabies virus

　　免疫核糖核酸具有传递免疫反应的作用^［1］，以往免疫核糖核酸都是从免疫动物的器官(肝、脾等)中提取，提取的免疫核糖核酸有效含量较低，其疗效不尽人意。本文从分泌抗狂犬病毒糖蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取核糖核酸,观察其抗病毒作用，旨在寻找制备高浓度、高特异性免疫核糖核酸的新方法，并对其作用机理作进一步研究。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料　分泌抗狂犬病毒糖蛋白单克隆抗体(IgM)杂交瘤细胞、人用狂犬病浓缩疫苗(批号：970512)、CVS 8代狂犬病毒毒种、12 g左右小白鼠、8周龄Balb/c小鼠等均由卫生部武汉生物制品研究所制备或提供。

　　1.2　 实体瘤的制备^［2］　 将培养的分泌抗狂犬病毒糖蛋白单克隆抗体(IgM)杂交瘤细胞注射入Balb/c小鼠背部脊柱两侧皮下，10 d左右手术摘取实体瘤。

　　1.3　杂交瘤细胞核糖核酸的提取　 采用热酚法^［3］。将获得的杂交瘤匀浆，用pH＜7.0的水饱和酚进行抽提。核糖核酸的紫外吸收值A260/A230、A260/A280均应大于1.9。核糖核酸的含量根据下面公式计算： RNA浓度＝OD260/0.022×稀释度÷1 000＝mg RNA/ml。

　　1.4　提取阳性核糖核酸　 将人用狂犬病浓缩疫苗5倍稀释^［4］，腹腔免疫Balb/c小白鼠，每只0.5 ml，1 w后加强免疫，14 d手术取脾脏。热酚法提取脾脏细胞核糖核酸。

　　1.5　提取阴性核糖核酸　 取正常Balb/c小白鼠脾脏，热酚法提取核糖核酸。

　　1.6　小白鼠腹腔注射核糖核酸　 将杂交瘤细胞细胞核糖核酸、免疫Balb/c小鼠脾脏细胞核糖核酸、正常Balb/c小鼠脾脏核糖核酸分别注射到体重12 g左右的小白鼠腹腔，20 μg/只。每种核糖核酸注射15只小白鼠。

　　1.7　颅腔攻击小白鼠　 小白鼠注射核糖核酸4 w后用狂犬病毒CVS株进行颅腔攻击^［4］，每只小白鼠的攻击病毒量为32 LD50。另取15只同期正常小白鼠进行同样的攻击作为空白对照。

　　1.8　检测血清抗体　 攻击后第0、3、7、14 天剪尾收集小白鼠血清，用ELISA检测血清抗体^［5］。

　　1.9　结果统计　 攻击4 d后开始计数，每天观察小白鼠发病和死亡的情况，直到攻击后的第14 天完成实验，统计结果。

　　2　结果

　　2.1　血清抗体检测　 实验组、对照组和空白组动物血清抗体水平无显著差别。

　　2.2　动物发病、死亡时间　 攻击4 d后开始计数，在这之前病、死的小白鼠数量应不计在内。结果见表1。动物50％死亡和100％的情况见图1。 从上面图表看出，杂交瘤细胞核糖核酸、人用狂犬病疫苗免疫小鼠的脾细胞核糖核酸不能阻止动物发病，但可以明显推迟动物的死亡时间。

表1　小白鼠被CVS攻击后的统计结果

　　Tab.1　The record result of mice attacked by CVS

Group	4th	7th		8th		9th		10th		11th		12th		13th		14th
	Total	S	D	S	D	S	D	S	D	S	D	S	D	S	D	S	D
1	14	0	0	14	0	11	0	10	1	8	4	5	7	0	12	0	12
2	14	0	0	14	0	14	0	13	1	12	2	9	5	2	12	0	14
3	14	0	0	14	0	6	8	5	9	0	14	0	0	0	0	0	0
4	14	0	0	14	0	6	8	2	12	0	14	0	0	0	0	0	0

Note:1.RNA from hybridoma cell； 2.Positive control； 3.Negative control； 4.Blank control; S.Sick mice; D.Dead mice

图1　小白鼠被CVS攻击后50%和100%死亡情况

　　Fig.1　The statue of the mice attacked by CVS from rabies coming on to 50% and 100%

　　Note:D50:the death rate of 50%； D100:the death rate of 100%； 1:RNA from hybridoma cell； 2:Positive control； 3:Negative control； 4:Blank control

　　3　讨论

　　动物实验结果，杂交瘤细胞核糖核酸和常规方法制备的免疫核糖核酸均能够明显延长动物的生存时间，证明杂交瘤细胞中提取的核糖核酸与常规方法制备的免疫核糖核酸一样，具有一定的免疫传递和免疫保护作用。虽然杂交瘤细胞核糖核酸和常规方法制备的免疫核糖核酸均不能使动物完全产生抵抗病毒感染的能力，而最终死亡。但应该考虑本实验所使用的动物模型的局限性，因为现有的狂犬病模型直接用狂犬病毒CVS株进行颅腔攻击，病毒在脑部大量增殖导致动物发病死亡，免疫核糖核酸在这个过程中是否来得及完全起作用还不得而知，因此不能排除免疫核糖核酸在预防或治疗其它系统疾病会有更好的效果。本实验所用杂交瘤细胞核糖核酸是从分泌抗体类型为IgM的杂交瘤细胞中提取的，对狂犬病而言，抗体类型为IgM的抗体，无论其是抗糖蛋白还是抗核蛋白都是非中和性抗体^［6］。从分泌非中和性抗体的杂交瘤细胞中提取的核糖核酸有明显延长动物生存时间的作用，证明免疫核糖核酸有着不同寻常的作用方式。尽管本实验采用分泌抗狂犬病毒糖蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞核糖核酸，但未能检测到小鼠产生特异性抗狂犬病毒糖蛋白的抗体，这一结果给出了如下提示：①免疫核糖核酸的体液免疫传递作用不是由分泌IgM类抗体的B淋巴细胞的核糖核酸产生，②对狂犬病动物模型而言，能够传递体液免疫反应的细胞核糖核酸可能较非传递体液反应的细胞核糖核酸要好，因为常规抗狂犬病毒血清具有肯定的保护作用，③免疫核糖核酸可以传递非体液免疫信息，而且这种非体液免疫反应有一定的抗病毒作用，④B淋巴细胞的核糖核酸能够传递免疫反应信息，但不一定是体液免疫反应的信息。 综合整个实验结果，从分泌抗狂犬病毒糖蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取的核糖核酸与从用人用狂犬病浓缩疫苗免疫小鼠的脾细胞中提取的核糖核酸腹腔注射小鼠有着相同的作用，均能明显延长实验动物的生存期，因此杂交瘤细胞中提取的核糖核酸可以认为是一种免疫核糖核酸，它具有一定的抗病毒作用，证明能够用杂交瘤细胞制备免疫核糖核酸，解决传统的从免疫动物的肝、脾等细胞中制备免疫核糖核酸存在的问题，为制备高质量的免疫核糖核酸及其应用，进一步研究免疫核糖核酸的作用机理提供了新的方法和途径。

　　作者简介：张　涛，29岁，硕士生；

　　封江南，37岁，副研究员，硕士生导师

　　参考文献

　　1　Adler F L. Meeting report: RNA in the immune response. Cell Immunol, 1972; 5:363

　　2　徐志凯.实用单克隆抗体技术.西安：陕西科学技术出版社，1992：94-94

　　3　卢锦汉，章以浩，赵　铠主编. 医学生物制品学. 北京：人民卫生出版社，1995：336-340

　　4　中国生物制品规程.北京：中国人口出版社，1995：121-124

　　5　Olaf Tbraenbart, Kandiab Ramakrisbnan. Standardization of an enzyme immunoassay for the in vitro potency assay of inactivated tissue culture rabies vaccines: determination of the rabies virus glycoprotein with polyclonal antisea. Journal of Biological Standardization, 1989;17:291

　　6　林放涛，于恩庶. 狂犬病学. 福州：福建科学技术出版社，1992：51

　　7　Stewart S, John M. Transfer of Immunity with RNA. Arch Pathol Lab Ed, 1978; 102:217

收稿日期:1998-08-09　修回1999-02-04