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一株特殊功能的抗人CD40单克隆抗体的获得及其生物学特性分析①
中国免疫学杂志 1999年第12期第15卷 分子与细胞免疫学
作者：周照华 王江方 王月丹 邱玉华 潘建忠 谢玮 蒋令瑜 张学光
单位：苏州医学院免疫教研室，苏州215007
关键词：CD40；单克隆抗体；B细胞；树突状细胞；多发性骨髓瘤
摘 要 目的：研制功能性抗人CD40单克隆抗体，从而探讨其对B细胞、DCs表达的CD40分子激发所产生的生物学效应。方法：采用细胞融合、单克隆抗体筛选、荧光标记、免疫印迹和竞争抑制等方法获得鼠抗人CD40mAb，以细胞增殖、分化抗原表达观察CD40mAb对B细胞和DCs的作用效应。结果：经表型分析、Western blotting鉴定和竞争抑制试验，证实5C11是识别人CD40分子的特异性单抗；5C11与转导CD32的L细胞（LCD32）联合IL-4能使扁桃体B细胞扩增并形成集落；5C11能介导树突状细胞（DCs）的扩增和分化成熟。结论：用5C11与LCD32建立的CD40培养体系，能使B细胞长期生存和增殖，为体外研究B细胞提供有效手段；5C11诱导外周单核细胞分化成熟为树突状细胞，这一发现为体外大规模扩增可用于治疗的DCs提供了新的手段，因而5C11是一株具有特殊功能和重要应用价值的单克隆抗体。
中国图书分类号 R392.11
The obtaining of an anti-human CD40 mono-clonal antibody with special functions and the analysis of it's biological effects
ZHOU Zhao-Hua, WANG Jiang-Fang, WANG Yue-Dan et al.
Department of Immunology, Suzhou Medical College, Suzhou 215007
Abstract Objective： To prepare mouse anti-human CD40 antigen functional monoclonal antibody and to further study it's biological effects by triggering the CD40 molecules on B cells and dendritic cells(DCs) . Methods: Using cell fusion, McAb screening , immunofluorescence analysis, immunoblotting and competition test to obtain mouse anti-human CD40 McAb； by the proliferation assay of B cells and DCs, and the analysis of expression of differentiation antigens on DCs. Results: On the basis of phenotype analysis, Western blotting and competition test, it is verified that 5C11 recognizes human CD40 antigens specially; 5C11 can augement the proliferation of tonsil B cells in the LCD32 cells and IL-4 culturing system; 5C11 can medicate DCs to get proliferation and maturation.Conclusion: 5C11+LCD32+IL-4 can make tonsil resting B cells survive and long-term proliferate in vitro, the setup of CD40 system furnish necessary tool for the study of B cells; McAb 5C11 also triggered the generation, proliferation and maturation of dendritic cells from peripheral blood monocytes. Thus 5C11 is a McAb with special function and important application value.
Key words CD40 McAb B cells Dendritic cell Multi-myeloma
CD40是分子量为50 kD的细胞表面受体，表达于许多类型细胞，包括B细胞及抗原递呈细胞，是I 型跨膜糖蛋白，其基因定位于20q11，属神经生长因子受体(NGFR)/肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族成员［1］。CD40分子的激发及在其它一些因子协同作用下，可以促使B细胞的增殖、分化、Ig分泌及其类型转换［2］；同时CD40分子在树突状细胞和T淋巴细胞的激发及功能介导中也具有重要的作用［3］。文献所报道的抗CD40单克隆抗体（MAB89和G28.5）因其能与IgM抗体或佛波脂（Phorbol esters）协同作用致使纯化的B细胞扩增、分化、介导Ig的分泌及其类型转换而著名［4］。同时能否运用这类功能性单抗来研究其它免疫细胞（例如DCs）CD40分子的生物学效应，值得进一步探讨。本室成功获得一株稳定分泌鼠抗人CD40分子的杂交瘤细胞株（克隆5C11）。继而用纯化的单抗为工具，进一步探讨了CD40分子在正常B细胞的增殖、树突状细胞体外激发、扩增和分化成熟中的作用，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 XG1、XG2、XG6、XG7 是本室建立的多发性骨髓瘤细胞系，置于含10%胎牛血清及rIL-6 3 ng/ml的RPMI1640（Gibical 公司）中常规培养，其中XG2的CD40分子的表达异常高（阳性率为99%，荧光强度达 625），这为研制鼠抗人CD40分子的单克隆抗体提供了良好的抗原物质；B淋巴瘤细胞株Daudi，T急淋巴细胞株Jurkat（均购自ATCC）用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基在37℃，5%CO2中长期培养。LCD32为转染FcγRII（人CD32）的鼠成纤维细胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培养（法国B.Klein博士赠送 INSERM.U475）。这些细胞株均无支原体污染。
1.2 单克隆抗体的制备 将XG2细胞每只鼠107/500 μl（注射前经丝裂霉素处理）加入等体积的福氏不完全佐剂，免疫Balb/c小鼠（间隔3 w，共3次）。在末次免疫的第4天取小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞株按常规方法进行融合［5］ 。以XG2 细胞（阳性对照）及XG7细胞株（阴性对照），用间接免疫荧光法对杂交瘤培养上清进行初步筛选。继而用Daudi（阳性对照）及XG1细胞（阴性对照）作进一步筛选，阳性克隆以有限稀释法单克隆化。经过3次有限稀释法亚克隆，使克隆的阳性率达99%，并在体外持续传代，分批冻存。
1.3 单抗的特性鉴定 McAb 5C11效价测定：诱生腹水按本室建立的常规方法进行，效价测定采用间接免疫荧光法；McAb的Ig亚类测定，采用试纸快速测定（Argen公司，法国）；腹水型McAb 5C11的纯化及定量：按Pharmacia公司方案采用Protein G柱分离纯化，定量采用染料结合比色法（BSA标准蛋白作对照）［6］；CD40分子在各类细胞系上的表达：采用常规的间接免疫荧光法，用流式细胞仪分析；抗体识别抗原位点的竞争实验：XG2及Daudi细胞1×106，先用纯化后的McAb 5C11 10 μg/100 μl孵育45 min, PBS洗涤2次，加鼠抗人CD40-PE 直标单抗（克隆MAB89，购自法国Immunotech公司）2 μg/100 μl孵育30 min，同时用CD40-PE 2 μg/100 μl作为阳性对照，鼠IgG1-PE（购自法国Immunotech公司）为阴性对照，用流式细胞仪分析细胞膜荧光表达强度；McAb 5C11的Western blotting 鉴定：将XG2、Daudi、XG7、XG2-B7、Jurkat细胞各1×107用PBS洗2遍后，去除上清，加入50 μl 1×的加样缓冲液，在水中煮沸15 min，用10%SDS-PAGE凝胶进行分离，一抗为5C11，二抗为羊抗鼠Ig-POD （购自德国Boehringe公司），显色按该公司Western blot kit所提供的方法进行。
1.4 扁桃体B细胞的制取 按文献［7］进行，将外科手术的扁桃体除去包膜（标本获自苏州医学院附属第一医院五官科），压碎并筛网过滤，所得的单细胞悬液经2次E花环及Ficoll分离去除T细胞，再经贴壁培养2 h去除单核细胞，获得纯度＞98%的B细胞。CD40体外培养系统的建立［8］：将LCD32经丝裂霉素（5×107细胞，50 μg丝裂霉素/ml）处理，洗涤后调至5×104细胞/ml，分别加入5C11 1 μg/ml及重组IL-4(100 U/ml，购自Diaclone公司，法国）的不同组合（见结果部分），B细胞最终浓度为2×105 ml-1，于24孔培养板中培养。于培养的5、10、15 d计数（台盼蓝染色）。每隔5 d在调整细胞浓度后，更换新鲜的培养基及LCD32。每组作3个复孔。
1.5 树突状细胞的诱导 按本室建立的方法进行［9］ ：供血员新鲜外周血用Ficoll/Paque密度梯度离心分离得到单个核细胞（PBMNC），将PBMNC按每孔1×107细胞/3 ml用含10%胎牛血清的RPMI1640培养（6孔培养板），2 h后去除非贴壁细胞，贴壁生长的单核细胞加不同组合的细胞因子（GM-CSF、IL-4、TNF）、CD40L转基因细胞和CD40mAb-5C11，于培养的第7天检测DCs的诱导率及表型。
2 结果
2.1 CD40分子在人MM细胞及淋巴瘤细胞上的表达 结果如同表1所示，XG2异常高表达CD40分子， Daudi细胞强表达CD40，XG6有微弱的CD40分子表达，而XG1和XG7均不表达可检测性CD40分子。鉴此，XG2被选择作为免疫原细胞，而其它细胞作为阳性或阴性筛选的靶细胞。
表1 CD40分子在B淋巴细胞肿瘤细胞株上的表达(阳性率，荧光对数)
Tab.1 Expression of CD40 antigen on various B malignant cell lines(positive percentage,fluorescence log)
| XG1 | XG2 | XG6 | XG7 | Daudi | ||||
| MAB89 | - | 99% | 625 | 30.0% | 20 | - | 99% | 23 |
| 5C11 | - | 99% | 745 | 25.5% | 17 | - | 99% | 22 |
2.2 特异性分泌抗人CD40 mAb杂交瘤细胞株的建立 先后共融合了20块96孔板，克隆形成率为70%，检测率达90%，经复筛及亚克隆后有2个克隆（2G11和5C11）为稳定分泌特异性抗CD40分子的单克隆抗体，经体外持续传代（40代）后，仍能稳定分泌特异性抗体。
2.3 单抗的特性鉴定 腹水效价：免疫荧光测定腹水效价为1：1 000； McAb 5C11亚类鉴定为小鼠IgG1型； 5C11在各细胞系上的表达见表1、2，结果表明：5C11所识别的细胞谱系与Immunotech公司抗CD40mAb（克隆MAB89）相似；单抗的抗体竞争试验结果如图1所示，5C11能将XG2及Daudi上的CD40抗原位点100%封闭，与法国Immunotech公司CD40 mAb 识别位点相似；Western blotting显示5C11能识别分子量在50 kD左右的特异蛋白条带（图2）。
表2 CD40分子在淋巴细胞上的表达
Tab.2 Expression of CD40 antigen on lymphocytes
| PBMNC | T | MQ | B | DC | Tonsil B | ||||||
| MAB89 | 5% | + | - | 90% | + | 98% | + | 96% | +++ | 98% | ++ |
| 5C11 | 5% | + | - | 90% | + | 98% | + | 96% | +++ | 98% | ++ |
Note:5C11 and MAB89 recognize same pattern of CD40 molecule on a series of cell lines as well as lymphocytes(fluorescence intense:+positive,++bright, +++very bright)
图1 5C11和MAB89竞争抑制试验
Fig.1 Competition test of 5C11 with MAB89 McAbs
图2 Western blotting 分析
Fig.2 Western blotting analysis
Note: lane 1. prestained low molecular weight mark;
lane 2. XG7,an MM cell line which is CD40 negative;
lane 3. Daudi, a B lymphoma cell line which is CD40 well expressed;
lane 4. Raji, a B lymphoma cell line, which is CD40 positive;
lane 5. XG2,an MM cell line which is CD40 highly expressed
2.4 5C11对扁桃体B细胞增殖作用（图3） 在CD40体外培养系统中，5C11+IL-4+LCD32具有使扁桃体B细胞长期扩增的作用，在B细胞培养体系中加入抗CD40McAb 5C11和转染人CD32（FcγR）的鼠L细胞，在培养的24 h后即观察到B细胞成同源性聚集，继而呈大小不等的团簇状（图4)。
2.5 5C11对树突状细胞的增殖和分化 初步结果表明，5C11 能促使外周单核细胞来源的DCs扩增和分化成熟（图5 ），所诱导的DCsCD1a阳性率达80%， CD83阳性率达58% ，证实5C11能通过对CD40分子的激发作用，特别是在联合IL-4和GM-CSF可大幅度提高DCs的增殖和分化成熟，所得DCs在光镜下具有明显的树突状表型，且CD40、CD80、HLA-DR表达率提高（阳性率＞80%）。
图3 不同培养体系中B细胞的增殖作用
Fig.3 Proliferation of tonsil B cells in different culturing coundition
图4 扁桃体B细胞在CD40系统中成团簇状生长
Fig.4 Tonsil B cell proliferating in the CD40 system
图5 5C11对DCs的增殖和分化成熟的影响
Fig.5 Effect of 5C11 on proliferation and maturation of DCs
Note: Phenotypes of DCs were analyzed at the 8th day of culturing , the mark of DCs is CD1a and the mark of DCs' maturation is CD83
3 讨论
XG2为多发性骨髓瘤细胞株，异常高表达CD40分子，而XG1和XG7几乎不表达CD40分子，这就为免疫与鉴定单抗奠定了基础。而存在于细胞膜上的抗原分子由于是颗粒型抗原，免疫原性很强，且空间构向充分展现，为“天然”抗原，优于用可溶性CD40融合蛋白免疫制备的单抗。实验中也发现免疫小鼠的脾脏特别大，且产生结节，表明免疫反应强烈。但由于细胞膜上蛋白分子很多，这又为单抗的筛选带来一定的困难，而且获得特异性抗体的几率也很小，6次融合中，仅成功地获得了2株目的单抗。
CD40分子在B淋巴细胞生长和分化中是至关重要的。在CD40培养体系中，由于L细胞上的FcγRII能与CD40McAb的Fc部分共价结合，从而使与CD40 McAb结合的B细胞上的CD40分子发生交联，而使B细胞获得相应的信号而免于凋亡。用我们研制的CD40单抗建立的CD40体外培养系统能使B淋巴细胞增殖、分化、开启免疫球蛋白的分泌及其类型转换。这为研究B淋巴细胞的分化、发育、增殖及功能提供了良好的体外方法。
在特异性免疫反应中，特异性CTL的激发和扩增必须首先由Th细胞与APC细胞（DCs）相互作用，既而激发了的DCs再将信号传给CTL，其中DCs是在Th细胞和CTL之间起了桥梁的作用。然而，最近的研究发现：CTL的激发可以通过调控DCs上的CD40分子而绕过Th细胞,这无疑对激发体内CTL提供了新的手段［10］。同时，Peter 等最近报道，应用CD40L转基因细胞可以在不需要GM-CSF的情况下诱导外周单核细胞分化成熟为功能性树突状细胞［11］。我们的实验也证实用CD40mAb-5C11可以在无需GM-CSF的情况下，显著地扩增单核细胞来源的DCs，更有意义的是，经CD40mAb-5C11激发后的DCs不仅具有成熟的标志，还有很强的明显激发T细胞作用（结果待发表）。
综上所述，本室成功地获得一株特殊功能的抗CD40mAb，该单抗不仅具有文献报道的抗CD40mAb功能性单抗（MAB89，G28.5）的生物学作用，而且还发现CD40单抗5C11能诱导DCs的体外扩增及成熟，表明该单抗在肿瘤免疫研究中具有潜在临床应用价值。
资金项目：国家自然科学基金青年基金资助项目（No.39600056）和杰出人才基金资助项目（No.39625024）
作者简介：周照华，男，讲师，免疫学硕士研究生；
指导教师，张学光，男，教授，博士生导师，主要从事肿瘤免疫和免疫血液学研究
参考文献
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收稿1999-05-18 修回1999-07-19