抗纤复方及TGF-β对胶原基因启动子活性的影响①

抗纤复方及TGF-β对胶原基因启动子活性的影响①

中国免疫学杂志 1999年第12期第15卷 中医中药与免疫

作者：王皓　高春芳　孔宪涛

单位：第二军医大学附属长征医院临床免疫中心，上海200003

关键词：TGF-β；抗纤维复方；胶原；启动子

　　摘　要　目的：研究TGF-β及中药抗纤复方对小鼠前胶原α2(Ⅰ)基因上游启动子活性的影响。方法：以含小鼠胶原α2(Ⅰ)基因上游0.4、0.8、2.0 kb启动片段为研究靶序列，以氯霉素乙酰基转移酶（CAT)作报告基因，应用基因转染技术研究小鼠胶原启动子活性。结果：TGF-β可促进小鼠前胶原α2(Ⅰ)基因启动序列的启动活性，而中药抗纤复方可明显抑制其启动活性。结论：TGF-β和中药抗纤复方都可作用于胶原α2(Ⅰ)基因调控片段，进而促进或抑制胶原合成。

　　中国图书分类号　R392.2

The effect of Chinese herbal and TGF-β on promoter activity in

　　mouse α2(Ⅰ) procollagen gene

WANG Hao， GAO Chun-Fang, KONG Xian-Tao.

　　Clinical Immunology Center, Changzheng Hospital， Shanghai 200003

　　Abstract　Objective: To study the effect of TGF-β and Chinese herbal on promoter activity in mouse α2(Ⅰ) procollagen gene. Methods：The upper stream 0.4、0.8、2.0 kb sequences in mouse α2(Ⅰ) procollagen gene 5′ flanking region were studied with CAT as reporter gene and gene transfection method.Results： The result revealed that TGF-β increases promoter activity of mouse α2(Ⅰ) procollagen gene while Chinese herbal significantly inhibits the promoter activity.Conclusion： TGF-β and Chinese herbal increase or inhibit collagen synthesis by regulating promoter element in procollagen gene.

　　Key words　TGF-β　Anti-fibrotic compound　Collagen　Promoter

　　纤维化性疾病是多种器官慢性炎症反应的常见转归，早期诊断和治疗甚至逆转纤维化是临床的难点^［1］。文献报道TGF-β在纤维化过程中起重要作用，它能刺激细胞外基质（ECM)的产生，抑制蛋白酶和基质酶的活性，从而促使ECM沉积，促进纤维化发生发展。研究证明TGF-β单抗可抑制小鼠成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达^［2］，即TGF-β能促进胶原基因表达，但对其促纤维化机制尚不完全清楚。TGF-β本身促进胶原表达的作用可发生在转录水平或转录后水平，为进一步在基因水平探讨TGF-β促纤维化的作用机制^［3-5］，本文以含小鼠胶原α2(Ⅰ)基因上游0.4、0.8、2.0 kb启动片段为研究靶序列，探讨TGF-β对小鼠胶原α2(Ⅰ)基因上游不同长短启动序列转录活性有无促进作用。另外近年来发现中药在抗纤维化治疗中有较好的疗效，故本研究同时对中药抗纤维化复方的抗纤维化机制也进行探讨。

　　1　材料与方法

　　1.1　细胞和试剂　小鼠NIH/3T3细胞(中科院细胞所)以含10%FCS的1640(Gibco)培养，0.125%胰蛋白酶(Sigma)消化传代。rhTGF-β(Boehringer Mannheim)，中药抗纤维化复方以黄芪、丹参、郁金等配伍及提取的无菌制剂(上海曙光医院张斌博士惠赠)。

　　1.2　pCOL0.4、pCOL0.8重组体构建　含小鼠α2(Ⅰ) 胶原-2 kb～+54 bp序列的质粒pAZ1009由美国NIC Crombrugghe教授惠赠（参见图1）^［6］，重新构建的重组体所用载体为不含启动子，但含有SV40增强子、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的质粒pCAT-enhancer(promega 结构见图2)。 重组体pCOL0.4、pCOL0.8的启动子分别是以含小鼠α2(Ⅰ) 胶原-2 kb～+54 bp序列的质粒pAZ1009为模板的PCR扩增产物，两重组体分别含小鼠α2(Ⅰ) 胶原基因上游-348～＋54 bp、-780～＋54 bp片段，其正义PCR引物序列分别为：pCOL0.4: 5′-CATAGTCCAAGCTTCTGTAAAGAGCCCACGT-3′；pCOL0.8: 5′-CATAGTCCAAGCTTCCCCTCATCAACGAGAG-3′。上述两种重组体的反义引物相同，序列为：5′-TAGCATCCGTCGACAATCGTGGACCGTTCC-3′。两端引物分别含8个保护碱基和限制性内切酶HindⅢ、SalⅠ识别位点(下划线部分)。PCR按常规方法进行(PE-9600 PCR扩增仪)，扩增产物经纯化回收后，用HindⅢ、SalⅠ酶切并与经相同酶切形成粘末端的线性pCAT-enhancer载体经T4DNA连接酶(promega)连接，连接混和物转染至感受态大肠杆菌并筛选，经小量酶切鉴定正确后，大量扩增阳性克隆，抽提、纯化质粒重组体(Qiagen plasmid midi kit)，紫外分光光度计(Du-600，Beckman)测定得率和纯度。含小鼠α2(Ⅰ)胶原-2 kb～+54 bp质粒pAZ1009亦经扩增、抽提、纯化、定量后-20℃保存待用。

图1　含小鼠α2(1)胶原-2 kb～+54 bp片段(黑色部分)及CAT报告基因的质粒pAZ1009

　　Fig.1　Plasmid pAZ1009 contains -2 kb～+54 bp fragment of mouse α2(I) procollagen gene (black part)and CAT as reporter gene

图2　含有CAT报告基因的无启动子质粒载体pCAT-enhancer(promega)

　　Fig.2　Plasmid pCAT-enhancer without promoter and CAT as reporter gene

　　1.3　DNA转染及 TGF-β、抗纤复方处理　DNA转染采用Dosper脂质体转染法(Boehringer-Mannheim)，具体方法如下： NIH/3T3细胞以5×10⁵ /孔接种于6孔培养板(Nunc)，24 h后，换新鲜但不含FCS的培养基，质粒以脂质体/DNA复合物形式加入上述细胞培养孔中，同时转染碱性磷酸酶表达质粒pSVAP2(Merck&Co. Inc.惠赠)作内对照及含CAT的表达质粒(invitrogen)作阳性对照^［7］。转染后6 h，换新鲜含10%FCS的培养基，分别加入TGF-β 2 ng/ml， 中药抗纤维化复方5 、10 mg/ml继续培养36 h后，测报告基因CAT活性。

　　1.4　CAT及碱性磷酸酶(AP)活性测定　终止培养的细胞用预冷的PBS洗3遍，以裂解缓冲液(Boehringer-Mannheim)裂解细胞后，进行蛋白定量(Bradford法)、AP活性测定(Trace CB171半自动生化分析仪)及CAT-ELISA(Boehringer-Mannheim)定量。

　　2　结果

　　我们以含前胶原α2(Ⅰ)基因-2 kb～+54 bp的质粒pAZ1009为模板，PCR扩增得到2个具有相同3′端的长短分别为0.4、0.8 kb的片段分别作为启动子，与不含启动子的载体pCAT-enhancer 分别组成重组体pCOL0.4、pCOL0.8，重组体经酶切鉴定正确(参见图3，1%琼脂糖电泳)。胶原产生细胞(NIH/3T3)在转染上述重组体及pAZ1009后分别用 TGF-β及抗纤复方处理36 h后，ELISA测定细胞CAT表达量，同时测定蛋白浓度及AP活性，AP活性作为内对照以保持转染效率相同条件下比较CAT表达量，CAT测定结果用相应蛋白含量及AP活性校正后，分别以未经处理的细胞转染pCOL0.4、pCOL0.8、 pAZ1009后CAT表达量为1，经 TGF-β及抗纤复方处理的细胞CAT相对表达量见图 4，其实际启动CAT表达量及比值见表1，提示细胞以pAZ1009及两重组体转染后经 TGF-β处理，细胞CAT表达量均上升，而经抗纤复方处理后，其CAT表达水平明显下降。

表1　各组CAT表达量(ng/ml，

　　Tab.1　Expression volume of CAT (ng/ml,

	Control	TCF-β 　　(5 ng/ml)	Ratio	AFC 　　5 mg/ml	Ratio	AFC 　　(10 mg/ml)	Ratio
pAZ1009	24	52	2.10	16	0.67	6	0.25
pCOL0.4	178	232	1.30	153	0.86	72	0.40
pCOL0.8	397	426	1.10	402	1.00	2.64	0.67

Note: AFC.Anti-fibrotic compound

图3　两种重组体pCOL0.4、pCOL0.8、SalI-HindⅢ双酶切结果

　　Fig.3　Electrophoresis (1% agarose gel) of pCOL0.4，pCOL0.8 degested with SalI and Hind Ⅲ

　　Note: 1.pCOL0.4；2.pCOL0.8；3.100 bp DNA ladder marker

图4　TGF-β及抗纤复方处理的细胞CAT相对表达量

　　Fig.4　Relative expression levels of CAT in cells treated with TGF-β or anti-fibratic compound

　　3　讨论

　　以肝纤维化为典型例证的纤维化形成机制及抗纤维化药物研究已有较长历史， 现已明确纤维化形成中，间质细胞胶原等细胞外间质成分过度表达。其中组织损伤后纤维母细胞Ⅰ型胶原基因表达激活，参与硬化或纤维化。细胞因子是纤维化形成的重要调控因素，TGF-β是目前最为明确的致纤维化因子。总体来说，调节Ⅰ型胶原蛋白产生的机制可发生在转录水平和转录后水平， 其中转录水平的调节主要通过靶基因上顺式DNA序列与其反式蛋白因子相互作用完成。目前研究已在人、鼠Ⅰ型胶原基因启动子及第1个内含子中发现存在重要的调控序列^［8，9］。进一步对Ⅰ型胶原基因的研究还提示小鼠α2(Ⅰ) 胶原基因上游-2 kb～+54 bp序列足以调控下游胶原基因的特异性表达。为进一步明确其致纤维化因子TGF-β及抗纤维化药物的作用机制，我们以含小鼠α2(Ⅰ)胶原-2 kb～+54 bp序列为研究靶序列，并重新构建了含从-2 kb～+54 bp中长短不等的启动序列的重组体，选择其中含有较强启动活性片段的重组体pCOL0.4、pCOL0.8（已另著文报道)^［10］，以CAT为报告基因研究TGF-β和中药抗纤复方对小鼠胶原α2(Ⅰ)基因启动序列启动活性的影响，结果发现TGF-β能提高小鼠α2(Ⅰ) 胶原基因启动序列启动活性，从而促进Ⅰ型胶原基因表达，其中TGF-β对pAZ1009启动活性增强作用最为明显，达2.1倍，但其启动活性上升程度与文献报道有一定差异^［5］，这可能与所用靶序列种属不同及所用研究方法不同有关。其中转染的重组体pCOL0.8，其CAT表达量均明显高于pCOL0.4，故推测-780～-348 bp存在有正性调控元件。而以黄芪、丹参、郁金等配伍成的中药抗纤复方在临床上应用多年，已收到较好的疗效，我们的实验结果发现抗纤复方确能显著降低小鼠α2(Ⅰ) 胶原基因启动序列的启动活性，进而抑制Ⅰ型胶原基因表达，达到抗纤维化的目的，该结果为中药抗纤维化机理研究提供了有利的佐证。目前我们正进一步研究相应于小鼠α2(Ⅰ) 胶原-2 kb～+54 bp启动序列的DNA结合蛋白，有望在激活态胶原产生细胞及抗纤维化因子作用后的细胞中发现纤维化、抗纤维化相关的新的或特异核转录因子，这一研究将有助于我们进一步认识纤维化(硬化)发生及抗纤维化作用中胶原基因如何被转录激活或抑制，为纤维化的逆转及寻找抗纤维化药物提供新的途径和理论依据。

　　资金项目：本课题为国家自然科学基金资助项目(No. 39500068和No.C03030204)和长征医院　　　　　　208基金项目

　　作者简介：王　皓，男，27岁，技师，主要研究肝病分子生物学机制；

　　高春芳，女，35岁，博士，副研究员，主要研究肝纤维化的分子免疫机制

　　参考文献

　　1　Friedman S L. The cellular basis of hepatic fibrosis: Mechanisms and treatment strategies. N Engl J Med, 1993;328(25):1828

　　2　王　皓，高春芳， 孔宪涛. TGF-β单抗对NIH/3T3细胞增殖及前胶原Ⅲ表达的影响. 中华消化杂志, 1996；16（6）：323

　　3　Inagaki Y, Truter S, Tanaka S et al. Overlapping pathways mediate the opposing actions of TNF alpha and TGF beta on alpha2(I)collagen transcription. J Biol Chem, 1995;270(7):3353

　　4　高春芳， 孔宪涛，范列英. TNFα对NIH/3T3细胞、肝贮脂细胞增殖及前胶原表达的影响. 中华消化杂志, 1994；14(1)：25

　　5　Kahari V M, Chen Y Q, Su M W et al. Tumor necrosis factor alpha and interferon gamma suppress the activation of human type I collagen expression by TGF beta1. J Clin Invest, 1990;869(6):149

　　6　Schmidt A, Rossi P, Crombrugghe B. Transcriptional control of the mouse alpha2(I) collagen gene: functional deletion analysis of the promoter and evidence for cell-specific expression. Mol Cell Biol, 1986;6(2):347

　　7　Yoon K,Thiede M, Rodan G A. Alkaline phosphatase as a report enzyme. Gene, 1988;66(1):11

　　8　Li L, Artlett C M, Jimenez S A et al. Positive regulation of human alpha1(I) collagen promoter activity by transcriptional factor SP1. Gene, 1995；164:229

　　9　高春芳， 孔宪涛. 胶原转录反式调控因子研究进展. 国外医学^.分子生物学分册， 1997；4(3)：163

　　10　Gao C F, Wang H, Huang C et al.Study of activity of promoter from mouse procollagen gene. Chinese Medical J,1999;112(4):316

收稿1998-07-18　修回1999-06-20