人钙调素基因表达载体的构建及在大肠杆菌DH5α中的表达①

人钙调素基因表达载体的构建及在大肠杆菌DH5α中的表达①

中国免疫学杂志 2000年第2期第16卷 分子与细胞免疫学

作者：李晓军　武建国　郭大文　徐建平

单位：李晓军（南京军区南京总医院全军医学检验中心免疫室　南京210002）；武建国（南京军区南京总医院全军医学检验中心免疫室　南京210002）；郭大文（南京军区南京总医院全军医学检验中心免疫室　南京210002）；徐建平（南京军区南京总医院全军医学检验中心免疫室　南京210002）

关键词：钙调素；基因表达；大肠杆菌

　　摘　要：目的：构建人钙调素（CaM）基因表达载体并在大肠杆菌DH5α中高效表达人CaM蛋白。方法：用PCR方法获得人钙调素基因Ⅲ（hCaMⅢ cDNA），将其插入表达载体pBV220，构建重组表达质粒hCaMⅢ/pBV220，用酶切、DNA测序、PCR扩增鉴定阳性克隆。结果：阳性重组子在大肠杆菌DH5α中经温度诱导可高效表达CaM蛋白，经15%SDS-PAGE分析，可观察到一分子量与理论值相符（约17 kD）的诱导表达条带，其表达量占菌体蛋白总量的20%。进一步分析表达产物的性质表明，CaM主要以可溶性形式表达。Western blot结果证实，17 kD的表达条带可与标准鼠抗CaM McAb起特异反应。结论：用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达人CaM，为进一步研究CaM的生物学功能及研制抗CaM单克隆抗体奠定基础。

　　分类号：R392　Q78

Construction of human calmodulin gene expression vector and expression of calmodulin protein in E.coli DH5α

LI Xiao-Jun

　　（Department of Immunology,Center of Medical Laboratory Science of PLA, Nanjing General Hospital of Nanjing Command , Nanjing 210002）

　　WU Jian-Guo

　　）Department of Immunology,Center of Medical Laboratory Science of PLA, Nanjing General Hospital of Nanjing Command , Nanjing 210002）

　　GUO Da-Wen

　　（Department of Immunology,Center of Medical Laboratory Science of PLA, Nanjing General Hospital of Nanjing Command , Nanjing 210002）

　　Abstract　Objective:To construct the human calmodulin（CaM）Ⅲ cDNA expression vector and express CaM protein in E.coli. DH5α.Methods:The gene code for human calmodulin （hCaM） was amplified by PCR in which pUC/hCaMⅢ cDNA was used as templete.After inserting the hCaMⅢ cDNA into the expression plasmid pBV220. The authors constructed the hCaMⅢ cDNA-recombinant expression vector （hCaMⅢ/pBV200） which was confirmed by DNA sequencing,restriction enzyme and PCR identifications. The recombinant plasmid was transformed into E.coli DH5α.Results:After heat induction,a high level expression of CaM protein was obtained.SDS-PAGE analysis showed that the recombinant E.coli could express a 17 kD protein which accounted for about 20% of the total cellular protein. The study of solubility of expression protein indicated that CaM was expressed predominantly in the soluble form.Western blot analyisis showed that anti-CaM McAb specifically bound to the 17 kD band of expression product.Conclusion:The expression of recombinant human CaM may be useful for the study of biological functions of CaM and the prduction of anti-rhCaM monoclonal antibodies.

　　Key words　Calmodulin 　Gene expression　E.coli▲

　　钙调素（Calmodulin,CaM）是一种广泛存在于真核细胞内的Ca²⁺结合蛋白，作为Ca²⁺在细胞内的主要受体，介导调控Ca²⁺引起的一系列生理生化反应，在细胞的增殖、分化、运动中起重要作用^［1］。CaM在进化上具有高度保守性，动物CaM来源多采用从人（或牛、猪等哺乳动物）的脑组织中提取的方法，操作繁琐，得率较低。国外已用基因工程方法制备重组人CaM^［2］，而国内尚无类似报道。本研究旨在通过构建人CaM基因Ⅲ（hCaMⅢ cDNA）表达载体，用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达人CaM，为进一步研究CaM的生物学功能及研制抗CaM单克隆抗体奠定基础。

　　1　材料与方法

　　1.1　质粒和菌种　含人CaM基因Ⅲ（hCaMⅢ　cDNA）全长（444 bp）的质粒载体（pUC/hCaMⅢ）由美国Strehler博士惠赠^［3］；表达载体pBV220，由中国预防医学科学院病毒所张智清教授构建，大肠杆菌DH5α由军事医学科学院基础医学研究所裴武红博士赠送。

　　1.2　酶及主要试剂　限制性内切酶EcoRI、BamHI、T4 DNA连接酶、质粒抽提试剂盒（Wizard Plus Minipreps DNA Purification System）购自Promega公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs为Sangon产品；PCR产物回收试剂盒（Hign Pure PCR Product Purification Kit）、琼脂糖凝胶回收试剂盒（Agarose Gel DNA Extraction Kit）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG购自宝灵曼公司。人CaM纯品，鼠抗人CaM McAb为Sigma公司产品。

　　1.3　质粒抽提、DNA酶切、连接、转化　操作均参照《分子克隆》介绍的方法或试剂盒说明书进行^［4］。

　　1.4　PCR引物设计　根据hCaMⅢ cDNA全长序列，在军事医学科学院基础医学研究所研制的核酸分析软件系统辅助下设计一对引物扩增目的基因片段。引物由加拿大Sangon上海生物工程公司合成。上游引物：5’-GGGAATTCATATGGCTGACCAGCTGAC-3’（内含EcoRI位点）；下游引物：5’-CGGGATCCTTACTTTGCAGTCATCATC-3’（内含BamHI位点）。

　　1.5　PCR扩增hCaMⅢcDNA　以pUC/hCaMⅢ为模板，采用30 μl反应体系，内含5×Buffer 6 μl，2.5 mmol/L dNTPs 2.4 μl，两端引物（18 μmol/L）各0.5 μl，模板0.5 μl，ddH₂O 19.1 μl，在95℃变性5 min后加Taq酶1 U，进入30个循环，扩增条件为:94℃变性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，最后72℃延伸7 min。PCR产物通过含EB的1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　1.6　pBV220/hCaMⅢ表达载体的构建　用Wizard Plus Minipreps DNA Product Purification System抽提质粒pBV220，同时用High Pure PCR Product Purification Kit 纯化PCR产物hCaMⅢ cDNA，两者经BamHI和EcoRI双酶切，用Agarose Gel DNA Extraction Kit 回收酶切片段，再用T4 DNA 连接酶将两者于4℃连接24 h，用CaCl₂法转化感受态DH5α。最后通过挑取菌落，抽提质粒，酶切鉴定及PCR扩增鉴定重组载体。

　　1.7　DNA序列测定　用我们构建的载体及设计的引物经大连宝生物工程公司用ABI PRISM^TM377 DNA 测序仪测定。

　　1.8　目的基因的诱导表达　含hCaMⅢ cDNA的重组菌于30℃活化过夜，1：100稀释到LB培养液中，继续在30℃摇床培养至对数生长中期，迅速转至42℃摇床继续培养4～6 h，分别于诱导前，诱导后1、2、3、4、5 h取菌液1 ml，离心收集菌体，直接溶于2×SDS凝胶加样缓冲液，用15%SDS-PAGE电泳分析。为分析表达产物的可溶性，收集诱导后重组菌，经冰浴超声粉碎，离心后取上清与沉淀分别进行SDS-PAGE。

　　1.9　Western blotting　收集诱导前后的重组菌，经15%SDS-PAGE（200 V，1 h）后，用电转印仪（Bio-Rad）转印至硝酸纤维素膜（0.45 μm,Bio-Rad）。转印条件，25 V，16 h，取出转印膜，用30 g/L BSA封闭，洗涤后依次浸泡于标准鼠抗hCaM McAb及HRP-羊抗小鼠IgG，室温下各反应1 h，洗后加入DAB-H₂O显色。

　　2　结果

　　2.1　目的基因扩增　用自行设计的一对引物，以pUC/hCaMⅢ为模板，扩增hCaMⅢ cDNA，扩增产物经1.2%琼脂糖电泳，结果显示一条特异条带，与目的基因444 bp相符（图1）。

图1　hCaMⅢ cDNA PCR扩增结果

　　Fig.1　PCR amplification of the hCaMⅢ cDNA

　　Note：　A.PCR marker; B.PCR product of the hCaM cDNA

　　2.2　表达载体的构建和鉴定　构建的载体经BamHI及EcoRI双酶切，或用表达载体作模板，经PCR扩增，均可获得与目的基因一致的清晰条带，未插入目的基因的空载体则无上述现象（图2）；DNA测序结果也提示，重组载体中目的基因的核苷酸序列与文献报道的hCaM Ⅲ cDNA序列完全一致。说明已成功构建pBV220/hCaMⅢ表达载体。

图2　重组载体限制性酶切和PCR产物鉴定结果

　　Fig.2　Restriction and PCR analysis of the recombinant plasmid pBV220/hCaMⅢ

　　Note:　1.λDNA/HindⅢ+EcoRI marker;2. pBV220 digested with EcoRI and BamHI;3.pBV220; 4.pBV220/hCaMⅢ；5.pBV220/hCaMⅢ digested with EcoRI and BamHI;6.pBR322/HinfI marker；7.PCR product of hCaMⅢ2.3　表达产物的分析与鉴定　重组菌经温度诱导后，用15%SDS-PAGE分析，观察到一分子量与理论值（约17 kD）相符的明显诱导表达带，经光密度扫描其表达量约占菌体蛋白的20%，即为人CaM蛋白，空载体（pBV220）转化菌及诱导前的重组菌均未出现相同条带（图3）。用常规冰浴超声法粉碎细菌，将离心后的上清及沉淀分别进行SDS-PAGE，结果表明表达产物绝大部分呈可溶性状态，因此可从超声上清中直接纯化CaM而不需从包涵体中提纯。Western Blotting 法也证实，诱导后重组菌表达的分子量约17 kD条带可与标准鼠抗CaM McAb的特异性结合并显色。

图3　人CaM在E.coli DH5α中表达的SDS-PAGE分析

　　Fig.3　SDS-PAGE analysis of hCaM expressed in E.coli DH5α

　　Note:　1.Induced DH5α/pBV220;2～6.Induced DH5α/pB220-hCaMⅢ for 1,2,3,4,5 h respectively; 7.Protein molecular weight marker

　　3　讨论

　　CaM与Ca²⁺结合构成胞内第二信使，介导细胞内多种依赖Ca²⁺的生理生化过程，包括分化、分泌、增殖、运动、代谢等。CaM基因研究结果表明，在哺乳动物类至少有3个CaM基因各自独立地表达氨基酸序列完全相同的CaM蛋白，构成一个CaM多基因家族，人类也如此，依先后依序称为hCaMⅠ、hCaMⅡ、CaMⅢ。这3个基因的cDNA序列已经清楚^{［3，5-7］}。尽管根据CaM的理论性质，从人、牛等脑组织中提取纯化CaM的方法已较成熟，但因得率较低。目前国外已有利用基因工程的方法制备hCaM的报道，每1 L重组菌液最终可得到CaM纯品4～6 mg^［2］，一旦投入规模生产，制备过程将较传统方法简单，得率也将会提高。目前国内尚未见有关研究报道。

　　本研究将hCaMⅢ cDNA 插入原核表达载体pBV220中，构建重组质粒pBV220/hCaMⅢ，以此转化大肠杆菌感受态DH5α，使其表达CaM蛋白获得成功。pBV220是一种温控型的非融合表达载体，其特点是调控基因CIts857与P_RP_L启动子有机地组合在同一载体上，便于转化多种菌株；同时还具备多克隆酶切位点和较强的转录终止信号^［8］。我们构建的重组菌经30℃活化，42℃诱导，通过15%SDS-PAGE分析，可见重组菌表达产物为分子量约17 kD的特异性条带，而空载体经诱导后则无这种条带。细菌经冰浴超声破碎，离心，取上清和沉淀分别进行SDS-PAGE，结果显示目的蛋白绝大部分位于上清，沉淀中含量极少，说明表达产物呈可溶性。有文献报道，表达菌株在高温下比在低温下生长更易形成包涵体，高温下不形成包涵体的蛋白往往脯氨酸含量低或含较多的酸性氨基酸，CaM呈可溶性表达也可能与CaM系一种酸性蛋白（酸性氨基酸占30%左右）有关。

　　致谢：本研究曾得到军事医学科学院沈倍奋教授，倪长源博士的指导和帮助，在此一并致谢。■

　　①江苏省自然科学基金资助项目（BK95141307）

　　作者简介：李晓军，女，35岁，医学硕士，从事自身免疫病实验诊断与发病机理研究；武建国，男，64岁，教授，主任医师，从事免疫学实验诊断研究

　　参考文献：

　　［1］Means A R,VanBerkum M F A,Bagchi I et al.Regulatory functions of calmodulin. Pharmac Ther, 1991；50:255

　　［2］Rhyner J A,Koller M,Durussel-Gerber I et al.Characterization of the human calmodulin-like protein expressed in Escherichia coli.Biochemistry,1992;31（51）:12826

　　［3］Fischer R,Koller M,Flura M et al.Multiple divergent mRNAs code for a single human calmodulin.J Biol Chem, 1988,263（32）:17055

　　［4］Sambrook J,Fritsch E F,Maniztis T C. 分子克隆实验指南. 第2版. 北京：科学技术出版社，1995：16-66

　　［5］Koller M, Schnyder B, Strehler E E.Structural organization of the human CaMⅢ calmodulin gene. Biochim Biophys Acta,1990；1087:180

　　［6］SenGupta B,Friedberg F, Detera-Wadleigh S D.Molecular Analysis of human and rat calmodulin complementary DNA clones.J Biol Chem, 1987；262（34）:16663

　　［7］Rhyner J A,Ottiger M,Wicki R et al.Structure of the human CALM1 calmodulin gene and identification of two CALM1-related pseudogenes CALM1P1 and CALM1P2.Eur J Biochem, 1994；225:71

　　［8］张智清，姚立红，侯云德. 含P_RP_L启动子的原核高效表达载体的组建及其应用. 病毒学报，1990;6（2）：111

收稿日期：1998-07-04

修回日期：1999-08-31