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间接ELISA法测定大肠杆菌DH5α菌体蛋白含量的实验研究
免疫学杂志 1999年第4期第15卷 技术与方法
作者：邓瑞春 白云秀 张明伟 汪劲松 黄 英 毛 宁
单位：军事医学科学院瑞得四环生物技术研究所 北京 100850
关键词：酶联免疫吸附测定 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 大肠杆菌
摘 要 采用大肠杆菌DH5α菌体蛋白免疫家兔制备抗血清，建立了间接ELISA方法。经初步测定，该方法的灵敏度为0．5ng／ml，比聚丙烯酰胺凝胶电泳的考马斯亮蓝染色方法的灵敏度高3 000倍，比银染色方法的灵敏度高150倍。在20～620ng／ml范围内测定呈直线关系，直线相关系数为0.895。经8次重复测定，显示很好的重复性。可用于测定rhGM-CSF等基因工程产品中DH5α菌体蛋白的残余量。
中图号 R371-34
DETERMINATION OF THE E．COLI DH5α PROTEIN REMAINS IN
GENIC ENGINEERING SEMI-FINISHED PRODUCT GM-CSF
Deng Ruichun， Bai Yunxiu， Zhang Mingwei， Wang Jinsong， Huang Ying， Mao Ning
（Read Four-Ring Institute of Biotechnology， Academy of Military Medical Sciences， Beijing 100850）
Abstract The antiserum were prepared against the total DH5α protein by immunizing rabbits， and then a method was established to determine the remnants E．coli DH5α protein in the gene engineering semi-finished pro-duct of rhGM-CSF． The sensitivity is about 0．5ng／ml， 3 000 times higher than that of Coomasie Briliant Blue stai-ning and 150 times than that of silver staining of PAGE． The linear range of the method is between 20-620ng／ml and the correlation coefficient（r） is 0．985， and repeativity is good．
Key words Enzyme-liked immunosorbentassay（ELISA），Recombine human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor（rhGM-CSF）， Escherichia coli（E．coli）
大肠杆菌DH5α是目前原核细胞表达系统中，应用最普遍的基因工程菌之一。人重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、人重组白细胞介素-2（rhIL-2）、人重组干扰素-α（rhIFN-α）等多种外源基因，都是在该宿主菌中获得高效转录和表达的。随着对基因工程产品在临床上的大量应用，对产品中宿主蛋白残余量的要求越来越严格。目前常用来鉴定残余蛋白的方法有：聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），毛细管电泳（CE），等电聚焦（IEF），HPLC（包括凝胶过滤，各种反相HPLC，离子色谱，疏水色谱等）。此外，还有一些化学法如观察末端是否均一等等。本文建立了间接ELISA方法，它简便、快速、灵敏、经济，是一种非常值得推广的方法。
1 材料和方法
1.1 材料
大肠杆菌DH5α菌体蛋白，由本室培养制备；HRP-羊抗兔IgG，购自本院微生物流行病学研究所；Western印迹试剂盒，购自Sigma公司；卡介苗，购自北京生物制品所。BDSL Immunoskan 340型酶联仪，英国；电泳仪，购自北京六一仪器厂。
1.2 方法
1.2.1 大肠杆菌DH5α培养及菌体蛋白的测定［3，4］：于LB培养基中培养大肠杆菌DH5α，经离心收集菌体，生理盐水洗2次，超声破碎，离心15 000r／min 10min，收集上清菌体蛋白，紫外分光光度法测定蛋白光吸收值，通过公式：mg／ml蛋白＝1．45×OD280－0．74×OD260计算含量，SDS-PAGE对DH5α菌体蛋白成分进行分析。
1．2.2 大肠杆菌DH5α菌体蛋白免疫：于免疫前1周，兔两侧腹股沟淋巴结注射卡介苗0．7mg，取4mg大肠杆菌DH5α菌体蛋白与1ml福氏完全佐剂混合，制成乳剂，于背部皮下多点免疫；2周后，注射不完全佐剂，免疫原剂量同前。随后，每隔2周加强1次，连续注射3次，最后1次自腹腔注射9mg抗原蛋白。7d后放血，收集血清，分装，于－20°C保存。
1.2.3 抗体效价测定：按文献［1］琼脂糖免疫双相扩散法。制备1％琼脂糖胶，铺板，打梅花孔。中心孔加1mg／ml菌体蛋白，周边孔加入倍比稀释的抗血清，放湿盒中，48h后观察结果。
ELISA方法按文献［1］的方法。抗原包被量为4μg／ml，HRP-羊抗兔IgG的使用浓度为1 000倍稀释，底物为邻苯二胺。
1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳：按文献［3］进行。分离胶浓度8％，浓缩胶浓度5％。电极缓冲液25mmol／L Tris-192mmol／L甘氨酸。
1.2.5 银染方法：将电泳胶用50％乙醇-12％醋酸固定20min，10％乙醇-5％醋酸洗3次，每次10min。取0．25％ K2Cr2O7溶液浸泡7min，用去离子水洗2次，每次2min。将电泳胶浸泡于0．2％ AgNO3溶液中，在20W日光灯下爆光20min，关灯放置20min，期间摇动若干次，至无色为止。无离子水洗3次，每次0.5min于摇动中加入0．28mol／L Na2CO3-0．05％甲醛，2～3次，视显色情况而定。1％醋酸定影10min，然后保存于去离子水中。
1.2.6 Western印迹实验：见参考文献［3］。电泳分离的蛋白带转移至硝酸纤维素膜上，封闭膜上非特异性结合位点，加入兔抗大肠杆菌DH5α菌体蛋白血清，清洗后加酶标二抗，温育后清洗，用3.3′-二氨基联苯胺（DAB）染色。
1.2.7 免疫电泳：见参考文献［1］。
1.2.8 测定大肠杆菌DH5α菌体蛋白的间接ELISA分析法：用0．05mol／L pH9．5碳酸盐缓冲液稀释的DH5α抗原溶液包被聚苯乙烯板，放4°C过液，次日用PBST洗涤3次，每次振荡3min。3％ BSA-PBST封闭，37°C温育1h，同上洗涤。加入用1％BSA-PBST稀释的兔抗DH5 α抗血清，37°C温育1h，同上洗涤。加1％BSA-PBST配制的HRP-羊抗兔IgG，37°C温育1h，同上洗涤。加底物液，避光反应20min， 2mol／L H2SO4终止反应后，492nm测定吸光度。
2 结果与分析
2.1 抗血清效价测定 用DH5 α全菌蛋白作为抗原，免疫7只家兔，每只家兔免疫5次，所用抗原量分别为：4，4，4，10和9mg。用琼脂糖免疫双扩散法测定抗体效价。从表1可见，当免疫第3次（约定42d）时，抗体效价即可达1∶64倍，第4次时可达1∶128倍。但免疫到第5次时并未见效价继续升高。
表1 兔抗大肠杆菌DH5α菌体蛋白抗血清效价
Tab 1 The titer of the antisera against the total DH5α proteins
| Animal number | Immunodiffusion | ELISA （104） | ||
| Third | Fourth | Fifth | ||
| 1 | 1∶64 | 1∶128 | 1∶128 | 1∶512 |
| 2 | 1∶64 | 1∶128 | 1∶128 | 1∶512 |
| 3 | 1∶64 | 1∶128 | 1∶128 | 1∶512 |
| 4 | 1∶64 | 1∶128 | 1∶128 | 1∶512 |
| 5 | 1∶16 | 1∶64 | 1∶64 | 1∶512 |
| 6 | 1∶64 | 1∶128 | 1∶64 | 1∶256 |
| 7 | 1∶16 | 1∶32 | 1∶128 | 1∶512 |
表中还列出了ELISA法测定结果，即：除第6号家兔抗体效价稍低（1∶256×104）外，其余6只家兔抗体效价均达到1∶512×104。说明我们已经制备了高效价的抗血清。
2.2 抗体特异性测定 图1为琼脂糖免疫电泳结果。7只家兔抗血清与抗原之间都能产生沉淀线，但不同个体所产生的沉淀线深浅度并不一样，这说明不同个体对不同抗原的免疫反应强度不同。该结果提示：在将抗体作为免疫诊断试剂使用时，应使用混合血清的抗体，这对保证所建方法有好的重复性，具有十分重要的意义。
图 1琼脂糖免疫电泳
Fig 1Agrose immunoelectrophoresis
①～⑦ antisera of rabbits to E．coli DH5 α proteins respectively；⑧ The mixture of the seven rabbits antisera； ⑨The total DH5α proteins
图2为DH5α菌体蛋白与抗体间的免疫印迹反应。首先，本实验免疫的7只家兔的抗血清，与抗原蛋白之间都能产生免疫印迹条带，说明每种抗原都已刺激机体产生了相应的抗体。换句话说，我们制备的抗体，能与任何DH5α抗原反应。但与GM-CSF之间没有免疫印迹条带出现。说明这些抗体不与GM-CSF反应。可见，我们制备的抗体，不仅效价高，而且特异性好，它能特异地与GM-CSF等基因工程产品的宿主蛋白反应，但不能与这些基因工程产物反应。
2．3 方法的灵敏度、重复性和标准曲线 用间接ELISA方法测定该方法的灵敏度，结果见表2。从表2可见，当抗体稀释5×104倍时，可测抗原浓度为0.5ng／ml。显示该方法具有较好的灵敏度，实验共重复8次，说明该方法具有很好的重复性。
图 2DH5 α与抗体间的免疫印迹反应
Fig 2The western blot betwean DH5α and antisera
（1）～（7）antisera of rabbits to E．coli DH5 α proteins respectivily；（8）The mixture of the seven rabbits antisera；（9）Nor-mal rabbits serum； （10）、（12）GM-CSF；（11）Marker
表2 ELISA法测定DH5 α菌体蛋白的灵敏度、重复性（抗体稀释5×104）
Tab 2 The sensitivity and respectivity of the ELISA method
（The antibody is diluted 5×104）
| Concentration of antigen（ng／ml） | A492nm（ |
| 10000 | 3．027±0．081 |
| 3300 | 2．739±0．099 |
| 1100 | 2．197±0．163 |
| 370 | 1．235±0．085 |
| 120 | 0．519±0．079 |
| 40 | 0．182±0．037 |
| 14 | 0．065±0．021 |
| 5 | 0．027±0．010 |
| 1．5 | 0．016±0．004 |
| 0．5 | 0．008±0．004 |
| 0．17 | 0．007±0．007 |
| Ctrl | 0．001±0．006 |
2．4 ELISA法测定DH5 α的标准曲线 从图3可见，在20ng／ml到620 ng／ml范围内呈直线关系，直线回归系数为0.985，说明在此直线范围内，测定的结果比较接近。
2．5 与PAGE方法比较 将DH5α蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，进行考马斯亮兰染色和银染，前者最小检测值为1 500ng／ml，后者最小检测值为75ng／ml。两种方法检测灵敏度分别低于本实验建立的ELISA方法（0．5 ng／ml）3 000倍和150倍。进一步说明本实验建立的方法具有较好的灵敏度。适合于基因工程产品中残余蛋白的检测。
图 3间接ELISA法动力学曲线
Fig 3The kinetic curve of indirect ELISA
3 讨论
大肠杆菌DH5α在基因工程产品中的残余量，直接影响到产品的质量。快速准确地测定DH5α的残余量，对产品的质量控制具有重要意义，其检测方法尚在不断改进和完善。目前常用的SDS-PAGE法灵敏度较低，且操作繁琐，耗时较长。毛细管电泳和高效液相色谱法虽然灵敏度较高，但需昂贵仪器，非一般实验室所能接受。
本文建立的间接ELISA方法，通过对DH5α蛋白及rhGM-CSF样品进行初步测量显示：它的灵敏度很高，可测定0．5 ng／ml菌体蛋白量，比现在常用的聚丙烯酰胺的考马斯亮兰染色方法的灵敏度高3 000倍，比银染色方法灵敏度高150倍。标准曲线范围在20～620 ng／ml，直线回归系数为0.985。重复性、稳定性都较好，方法简便、快速。我们认为，该方法可以应用于基因工程产品中菌体蛋白残余量检测。
（致谢 本文曾得到丁广志教授和樊玉伟同志的热情帮助，特此致谢。）
第一作者：女，37岁，硕士，助理研究员
参考文献
1 李成文.现代免疫化学技术.上海：上海科学技术出版社，1990.8
2 张龙翔，吴国利.高级生物化学实验选编.北京：高等教育出版社，1989.9
3 J.萨母布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯著.分子克隆实验指南.第2版.金冬雁、黎孟枫、侯云德等译，北京：科学出版社，1992
4 张龙翔，张庭芳，李令媛.生化实验方法和技术.第2版.北京：高等教育出版社，1997
（1998-09-23收稿；1999-03-16修回）