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重组人截短型胰岛素样生长因子1在大肠杆菌中的高效表达①
中国免疫学杂志 2000年第2期第16卷 分子与细胞免疫学
作者：李莹 邓鸿业 狄春辉 施群 韩文玲 马大龙
单位：李 莹（北京医科大学免疫系 北京100083）；邓鸿业（北京医科大学免疫系 北京100083）；狄春辉（北京医科大学免疫系 北京100083）；施 群（北京医科大学免疫系 北京100083）；马大龙（北京医科大学免疫系 北京100083）
关键词：人截短型胰岛素样生长因子1；大肠杆菌；高效表达
摘 要：目的:建立人截短型胰岛素样生长因子1的原核高效表达系统。方法：利用基因重组技术将人截短型胰岛素样生长因子1〔Des（1-3）IGF1〕的cDNA片段克隆到融合蛋白表达载体pMTY4中，用离子交换层析法纯化蛋白并经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、放射免疫检测、N-末端前16位氨基酸序列测定及生物活性检测等方法对所获蛋白进行了鉴定。结果：获得含人Des（1-3）IGF1基因的重组质粒，在大肠杆菌中高效表达出含凝血酶识别序列的MS2-Des（1-3）IGF1融合蛋白，该蛋白经凝血酶消化后纯化可获得与天然型一致的人Des（1-3）IGF1。结论：该方法是获得人重组Des（1-3）IGF1的有效途径，对进一步研究Des（1-3）IGF1有重要意义。
分类号：R392.11
High-level expression of human truncated insulin-like growth factor 1 in E.coli
LI Ying
（Department of Immunology, Beijing Medical University, Beijing100083）
DENG Hong-Ye
（Department of Immunology, Beijing Medical University, Beijing100083）
DI Chun-Hui
（Department of Immunology, Beijing Medical University, Beijing100083）
Abstract：Objective: To establish an efficient expression system for human truncated insulin-like growth factor 1 〔Des（1-3）IGF1〕as fusion protein in Escherichia coli（E.coli）.Methods: The cDNA of Des（1-3）IGF1 was cloned into an fusion protein expression plasmid, pMTY4, using gene recombinant technique. The protein was purified by ion exchange chromatography and identified by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, radioimmunoassay（RIA）, N-terminal amino acid sequence and biological activity.Results: A prokaryotic expression vector was constructed and the fusion protein containing MS2 polymerase fragment, thrombin recognition site and human Des（1-3）IGF1 was expressed in E.coli at high level. It was showed that the purified recombinant Des（1-3）IGF1 released from the fusion protein after digestion with thrombin was identical to the native Des（1-3）IGF1.Conclusion:This is an effective method for obtaining human recombinant Des（1-3）IGF1 and it is very important for further study of Des（1-3）IGF1.
Key words：Truncated insulin-like growth factor 1 E.coli High-level expression▲
胰岛素样生长因子1（IGF1）是70个氨基酸组成的多肽生长因子，具有胰岛素样效应和促进细胞生长的作用，对某些特定细胞有促进分化成熟的功能。Des（1-3）IGF1是体内天然存在的IGF1的截短形式，其N端缺失3个氨基酸Gly-Pro-Glu。实验证明，Des（1-3）IGF1刺激培养细胞增殖的能力较IGF1高10倍以上［1］ 。国外已有通过化学合成、组织提取、真核细胞表达及大肠杆菌分泌性表达获得Des（1-3）IGF1的报道，但表达量均较低［2-5］。本文利用融合蛋白表达技术，成功地在大肠杆菌中高效表达了MS2-Des（1-3）IGF1融合蛋白，经过凝血酶消化、离子交换层析获得了天然型序列的Des（1-3）IGF1，为进一步研究Des（1-3）IGF1的结构与功能打下了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 大肠杆菌POP2136 （C600衍生株，含CI857基因，编码温度敏感的λ阻遏蛋白），由Raidoud博士惠赠；DH5αF'IQTM 购自GIBCOL/BRL公司。
1.1.2 质粒 pGEM5zf和 pGEM3zf（+）质粒购自Promega公司；pBR322-IGF1质粒由北京医科大学心肺内分泌研究中心汤健教授惠赠；融合蛋白表达载体pMTY4为本室构建，它含有编码MS2聚合酶片段和凝血酶识别位点的基因［6］。
1.1.3 试剂 各种限制性内切酶、DNA修饰酶、核苷酸dNTP、ATP购自Promega公司、GIBCOL/BRL公司、华美公司等； WizardTM minipreps PCR product purification system and DNA purification system购自Promega公司；测序样品处理试剂盒Auto cycleTM sequencing kit购自Pharmacia公司；凝血酶购自中科院血研所；Q Sepharose XL和CM柱填料购自瑞典Pharmacia公司。
1.2 方法
1.2.1 人Des（1-3）IGF1原核表达质粒的构建 根据文献已公布的IGF1 cDNA序列，设计了第1对上游引物5'ACG CTC TGC GGG GCT GAG 3'和下游引物5' GTAAGCTTA AGC TGA CTT GGC AGG 3'。在下游引物中导入HindⅢ酶切识别位点（划线部分），以pBR322-IGF1为模板，在Stratagene 9600 PCR仪上扩增，将获得的Des（1-3）IGF1 PCR产物用Klenow酶处理以切去3'突出A，并纯化它。为了在下游引物的HindⅢ酶切位点后增加保护性碱基，将pGEM5zf用EcoRV处理，并与上述纯化的PCR产物连接，利用Des（1-3）IGF1上游引物和pUC/M13 Reverse引物作为第2对扩增引物，以上述连接产物为模板，进行PCR扩增。并将PCR产物依次用Klenow 和Hind III 处理，与已用StuI和Hind III处理的pMTY4载体连接，获得pMTY4-Des（1-3）IGF1表达载体。
1.2.2 核酸序列测定 pMTY4-Des（1-3）IGF1质粒用EcoRI、HindⅢ双酶切，将释放片段克隆到pGEM3zf（+）质粒中，用ALFTM DNA Sequencer（Pharmacia biotech）测序仪测序，测序反应按操作说明进行。所用酶及其他试剂均由Pharmacia biotech提供。
1.2.3 质粒的转化、筛选、诱导及细菌包涵体的获得 按文献［7，8］所述方法进行。
1.2.4 蛋白的纯化 将初步纯化的包涵体于变性液（50 mmol/L Tris.HCl pH8.5, 8 mol/L Urea, 20 mmol/L β-巯基乙醇）中，37℃，0.5 h，高速离心（16 000 r/min 15 min），并将离心上清用50 mmol/L Tris.HCl （pH8.5） 稀释至8～10倍体积，按5 U/mg蛋白加入凝血酶, 27℃ 17 h后，依次经过Q Sepharose XL阴离子交换层析柱和CM阳离子交换层析柱，收集各吸收峰进行Tris-Tricine缓冲系统的SDS-PAGE电泳。
1.2.5 表达产物的放射免疫学检测（RIA） rhIGF1标准品购自Promega公司，兔抗IGF1抗血清UB3189由北卡罗来那大学 Ungerwood 和VanWyk博士通过美国糖尿病消化病肾脏病协会惠赠。 Indogen （1,3,4,6-tetrachloro-3α6α-diphenylglycoluril）购自Sigma公司，rhIGF1的碘化标记方法见文献［9］，RIA方法见文献［10］。
1.2.6 氨基酸序列分析 将纯化的蛋白样品送交中国医学科学院基础所测定N-末端前16位氨基酸。
1.2.7 生物学活性测定 以NIH3T3为检测细胞株，用Pepro Tech EC 公司的IGF1 作标准品，MTT掺入法测定生物学活性。
2 结果
2.1 Des（1-3）IGF1基因的PCR扩增 根据已设计的2对引物分别进行PCR，得到210 bp和336 bp的片段，如图1所示，同预期大小一致。
图1 人Des（1-3）IGF1基因的2次PCR扩增结果
Fig. 1 Electrophoretic result of human Des（1-3）IGF1 gene amplified by PCR
Note:1. PCR markers：1 543，994，697，514，377，237 bp; 2. product using the first two primers; 3. product using the second two primers
2.2 pMTY4-Des（1-3）IGF1表达质粒的构建及初步鉴定 重组质粒按图2所示构建。通过转化、筛选，获得pMTY4-Des（1-3）IGF1质粒, PCR鉴定及NarI酶切鉴定都与预期结果一致（图略）。
图2 表达质粒pMTY4-Des（1-3）IGF1的构建图谱
Fig.2 The construction scheme of expression plasmid pMTY4-Des（1-3）IGF1
2.3 pMTY4-Des（1-3）IGF1表达载体中目的基因序列分析 将pMTY4-Des（1-3）IGF1质粒中凝血酶识别位点及Des（1-3）IGF1基因克隆至载体pGEM3zf（+）中进行序列测定，分析结果与已公布的序列完全一致［2］。
2.4 融合蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化 SDS-PAGE分析结果如图3所示，工程菌pMTY4-Des（1-3）IGF1/ POP2136的主要表达产物为18.2 kD左右的分子，凝血酶消化产物分别与MS2（11 kD）和Des（1-3）IGF1（约7.2 kD）的大小一致。通过凝胶成像系统分析表明，融合蛋白表达量占菌体的30%以上；将诱导后菌体超声裂解，并用洗液（2 mol/L Urea, 50 mmol/L Tris.HCl, 1 mmol/L EDTA）洗涤3次后，可得纯度为80%的包涵体；凝血酶酶切效率可达95%以上；经2种离子交换柱层析所得Des（1-3）IGF1纯度可达96%以上。
图3 表达及纯化产物的SDS-PAGE分析
Fig.3 SDS-PAGE analysis of the products of expression and purification
Note:（A） 1. inclusion bodies of Des（1-3）IGF1 fusion protein; 2. supernatant of denatured inclusion bodies; 3. un-induced E.coli POP2136; 4. low MW protein marker：3, 6.2, 14.3, 18.4 kD; 5. pMTY4-Des（1-3）IGF1/POP2136 by temperature induction; （B） 1.fusion protein in refolding solution; 2. supernatant subjected to thrombin digestion; 3. fraction purified by Q Sepharose XL；4. fraction purified by CM column; 5. low MW protein marker same as up
2.5 蛋白的抗原性检测 将融合蛋白的复性液、纯化后Des（1-3）IGF1及MS2-GM-CSF融合蛋白用PB分别作1、20倍和5、10倍的稀释，用RIA的方法进行检测，参照标准曲线算得样品含量，表1所示。可见2种稀释样品都具有与标记IGF1竞争结合抗IGF1多克隆抗体的能力，所得数值均呈倍数关系，而所加对照MS2-GM-CSF融合蛋白却无此特点，说明此MS2-Des（1-3）IGF1融合蛋白和Des（1-3）IGF1的纯化产品均有IGF1 的抗原性。
表1 蛋白的抗原性检测
Tab.1 Analysis of protein's antigenity
| Sample | Dilution
a |
Value of diluted
materials（pg） b |
Value of original
sample（pg）1） a×b |
| MS2-Des（1-3）IGF1
Fusion protein |
1
20 |
1 702.542
85.869 |
1 702.542
1 717.380 |
| Purified
Des（1-3）IGF1 |
5
10 |
259.315
130.493 |
1 296.575
1 304.930 |
| MS2-GM-CSF
Fusion protein |
5
10 |
0
0 |
0
0 |
Note： 1）protein content in sample calculated according to standard curve
2.6 生物学活性测定 与标准品比较，我们纯化的人重组Des（1-3）IGF1在2～40 μg/ml范围显示刺激3T3 细胞生长的活性。
2.7 氨基酸序列分析 纯化的人重组Des（1-3）IGF1蛋白样品进行N-末端氨基酸序列测定，前16位氨基酸残基分别为T-L-C-G-A-E-L-V-D-A-L-Q-F-V-C-G， 与天然Des（1-3）IGF1序列完全一致。
3 讨论
胰岛素样生长因子1（IGF1）是一种作用范围广泛的生物活性因子，其受体几乎存在于所有种类的细胞中，因此临床上已将IGF1试用于多种系统疾病的治疗，其中，在生长障碍和运动神经元疾病的治疗中，由于Des（1-3）IGF1的特殊性，其与IGF结合蛋白（IGF BP）的结合力仅相当于IGF1的1%［11］，因此可克服完整型IGF1在血液中绝大部分与IGF BP结合而不发挥生理作用的弊端。
国外文献报道，完整型IGF1在原核系统的天然表达非常不稳定［12］，提示Des（1-3）IGF1的天然蛋白在大肠杆菌中可能极易降解，而且Des（1-3）IGF1的融合蛋白在大肠杆菌的分泌性表达其产量较低,本文利用pMTY4质粒构建了含Des（1-3）IGF1基因的原核表达载体，以不溶性包涵体形式表达了其融合蛋白，这样既降低了Des（1-3）IGF1对蛋白酶的敏感性，又将蛋白的表达量提高至30％。MS2和Des（1-3）IGF1之间的凝血酶识别位点（Gly Val Arg Gly Pro Arg↓）有利于Des（1-3）IGF1从融合蛋白中释放出来而去除细菌MS2聚合酶片段。总之，本文通过对蛋白变性复性、凝血酶消化和2次离子交换层析，获得高纯度、具有抗原性和生物学活性的重组Des（1-3）IGF1，此技术路线为大规模生产Des（1-3）IGF1提供了可靠的实验依据。■① 国家自然科学基金资助项目（39570612）
作者简介：李 莹，女，29岁，博士生
参考文献：
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收稿日期：1999-04-18
修回日期：1999-07-24