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异基因型和同基因型MHC Ⅱ类基因转染对小鼠肥大细胞瘤免疫原性的影响
中国免疫学杂志 2000年第3期第16卷 肿瘤免疫学
作者：隋拥君 唐佩弦 侯春梅 毛宁
单位：隋拥君（军事医学科学院基础医学研究所，北京100850）；唐佩弦（军事医学科学院基础医学研究所，北京100850）；侯春梅（军事医学科学院基础医学研究所，北京100850）；毛宁（军事医学科学院基础医学研究所，北京100850）
关键词：MHCⅡ类基因转染；异基因型；同基因型；致瘤性；免疫原性
摘 要 目的：提高肿瘤细胞的免疫原性。方法：将异基因型或同基因型的MHCⅡ类基因转染至小鼠肥大细胞瘤P815中，用此细胞接种同系小鼠，1个月后给不成瘤的小鼠再接种野生型P815细胞，观察小鼠的存活情况。结果：转同基因型MHCⅡ基因的P815细胞接种同系小鼠后，4/10不成瘤，而异基因型MHCⅡ基因转染组，10/10不成瘤。1个月后给不成瘤的小鼠再接种野生型的P815细胞，同基因型转染组2/4不成瘤，异基因型转染组7/10不成瘤。结论：研究说明MHCⅡ基因转染具有使肿瘤细胞的致瘤性下降、免疫保护能力提高的作用；并且异基因型比同基因型MHCⅡ类基因转染的效果更佳。
中国图书分类号 R733
Allogeneic or syngeneic MHC class Ⅱ gene transfection and their effects on immunogenicity of murine mastocytoma
SUI Yong-Jun TANG Pei-Xian HOU Chun-Mei et al.
（Institute of Basic Medical Sciences ,Academy of Military Medical Sciences ,Beijing 100850）
Abstract：Objective:To enhance the immunogenicity of tumor cells.Methods:Allogeneic or syngeneic MHC class Ⅱ gene was transfected into murine mastocytoma P815.Then the transfected cells were inoculated into the syngeneic mice and one month later ,mice free of tumors were challenged with wild type P815 cells.The survival rate of the mice was observed.Results:4/10 mice were free of tumors when inoculated with syngeneic MHC class Ⅱ gene modified P815 cells,while 10/10 mice were free of tumors when inoculated with allogeneic one.One month later,the mice free of tumors were challenged with wild type P815 cell and the survival rate of syngeneic group was 2/4,while the allogeneic one was 7/10.Conclusion:Expression of MHC class Ⅱ molecular remarkably reduced the tumorigenicity of the modified cells and vaccination with MHC class Ⅱ-expressing P815 cells protected the mice from subsequent challenge with wild type P815 cells.Furthermore,allogeneic MHC class Ⅱ transfection was better than syngeneic one in their ability to generate immune-protection effects.
Key words：MHC class II gene transfection Allogeneic Syngeneic Tumorigenicity Immunogenicity
小鼠的肥大细胞瘤细胞系P815表达肿瘤特异性抗原P815A等［1］，但是一般情况下，免疫力健全的同系小鼠却无法产生针对P815细胞的免疫应答。其中的一个原因可能是P815细胞只表达MHCⅠ类抗原，而不表达Ⅱ类抗原。在肿瘤免疫中，至少需要2种T细胞：CD8＋T细胞识别肿瘤细胞上与MHCⅠ分子结合的特异性抗原，直接杀伤肿瘤细胞［2］；CD4＋T细胞识别抗原提呈细胞上的与MHCⅡ类分子结合的特异性抗原，激活后为CD8＋T细胞的激活提供辅助信号［3］。如果肿瘤细胞能够表达MHCⅡ类抗原，即可直接激活CD4+T细胞，而不需要经过宿主APC，可能会诱导更加有效的抗肿瘤免疫反应。在本研究中，我们用小鼠的肥大细胞瘤系P815，分别将小鼠的IAk和IAd基因转移到其中，构建了异基因型(Allogeneic)和同基因型(Syngeneic)MHC Ⅱ 类基因转染的模型，比较了它们的致瘤性和免疫原性的改变。
1 材料与方法
1.1 细胞系 小鼠肥大细胞瘤细胞系P815培养于DMEM培养液中，添加10%的小牛血清。
1.2 细胞转染 采用Lipofectamine转染法或者磷酸钙共沉淀法。连接在pcEXV-3载体中的IAkα和IAk β cDNA(由 Ostrand-Rosenberg S提供［4］)各10 μg以及pLXSN空载体1 μg混匀后共同转染P815细胞；连接在pcEXV-3载体中的IAd α和IAd β cDNA(由 Steiman R提供)各10 μg以及PLXSN空载体1 μg混匀后共同转染P815细胞，具体操作过程参照说明书。以上2种转染体都用600～800 μg/ml的G418进行筛选，直到出现抗性克隆。用转PLXSN空载体的P815细胞作对照。
1.3 流式细胞术检测细胞表面MHCⅡ类分子的表达 MK-D6mAb(ATCC)针对小鼠的IAd；OX-6(Sigma)mAb针对小鼠的IAk。流式细胞术分析过程如下：细胞经PBS洗涤后，调节细胞浓度为1×107ml-1，取100 μl细胞悬液加10 μl抗IAd或IAk抗体，室温孵育30 min，用含1%BSA的PBS(pH7.4)洗涤2次后，加FITC标记的羊抗小鼠二抗10 μl,室温孵育30 min，1%BSA的PBS(pH7.4)洗涤2次后，2%多聚甲醛固定，用于FCM检测(仪器为美国B-D公司FACStar)。
1.4 动物实验 同DBA/2雄性小鼠(北京医学科学院药品鉴定所)40只，随机分成4组，每组10只，分别皮下注射1×105以下各组细胞：P815、P815-空载体、P815-IAk和P815-IAd。3次/w观察肿瘤的生长情况。4 w 后，未成瘤的小鼠进行以下的实验：每只小鼠皮下注射1×105的野生型的P815细胞，3次/w观察肿瘤的生长情况，15 w后结束实验。
2 结果
2.1 同基因型和异基因型MHCⅡ类基因转染模型的构建 P815细胞是在DBA/2纯系小鼠(H-2 IAd)中诱导的肥大细胞瘤，经过FACS检测发现，其MHCⅡ类抗原的表达为阴性(见图1)。将IAd cDNA转到P815细胞后所获得的P815 -IAd细胞，因为MHCⅡ类抗原的表达与同系小鼠的MHCⅡ类抗原相一致，所以是同基因型MHCⅡ类抗原转染的模型；同样，将IAk cDNA转到P815细胞后所获得的P815-IAk细胞成为异基因型MHCⅡ类抗原转染的模型。我们应用lipofectamine转染法或者磷酸钙共转染的方法，在600～800 μg/ml G418浓度下经过大约14～21 d左右的筛选，分别获得了对G418具有抗性的以上2种细胞。为了检测这2种细胞中MHCⅡ类抗原的表达，我们用流式细胞术进行了分析，结果(见图1)表明：此2种细胞中都有相应的MHCⅡ类抗原的表达。
图1 流式细胞术分析野生型及转基因P815细胞中MHC Ⅱ基因的表达
Fig.1 Flow cytometric analyses of syngeneic or allogeneic MHC class Ⅱ gene expression on wild type and transfected P815 cells
Note:a.P815-IAd cells were staining of fluorescent conjugate without IAd mAb;b.P815 cells were staining of IAd mAb plus fluorescent conjugate;c.P815-IAd cells were staining of IAd mAb plus fluorescent conjugate;d.P815-IAk cells were staining of fluorescent conjugate without IAk mAb;e.P815 cells were staining of IAk mAb plus fluorescent conjugate;f.P815-IAk cells were staining of IAk plus fluorescent conjugate
2.2 转染MHCⅡ类基因的P815细胞的致瘤性下降 转染了同基因型和异基因型MHCⅡ类基因的P815-IAd和P815-IAk细胞接种在P815细胞的同系小鼠DBA/2皮下后都不同程度出现了肿瘤生长缓慢或者不成瘤、小鼠的生存期延长或者长期存活的现象，表明其致瘤性出现了下降。从图2中我们可以看到，转染MHCⅡ类抗原的P815细胞的致瘤性是：P815-IAk＜P815-IAd，其中P815-IAk组10只小鼠在接种1个月后全部未成瘤，而对照组全部成瘤且瘤体平均直径超过16 mm。P815-IAd组仅部分小鼠(4只)不成瘤，但成瘤小鼠的瘤体直径小于对照组(P＜0.01)。
图2 MHCⅡ类基因转染到P815细胞体内生长的影响
Fig 2 Effects of MHC Ⅱ genes transfection on P815 cells growth in vivo
Note:P815-IAd has two lines,one(n=6) represents 6 mice with large tumor burdens;the other(n=4) represents 4 mice free of tumor
2.3 转染MHC Ⅱ类基因的P815细胞的免疫原性提高 第1次接种未成瘤的小鼠，在接种后1个月第2次接种野生型的P815细胞，结果如表1所示。我们发现2组小鼠的免疫原性都有所提高，可以保护后续的野生型P815细胞的攻击。它们对免疫原性提高的能力是：P815-IAk＞P815-IAd，显示了异基因型MHC Ⅱ类基因转染比同基因型MHC Ⅱ类基因转染具有更良好的作用效果。
表1 表达异基因型或同基因型MHC Ⅱ类分子的DBA/2小鼠P815细胞免疫保护野生型P815细胞的攻击
Tab.1 DBA/2 mice immunized with P815 cells expressing allogeneic or syngeneic MHC class Ⅱ genes are protected against challengess of wild-type P815 cells
| Cell injection | No.of mice
surviving1) |
No.of mice surviving after a
secondary challenge with P8151) |
| P815(105) | 0/10 | / |
| P815-PLXSN(105） | 0/10 | / |
| P815-IAk（105） | 10/10 | 7/10 |
| P815-IAd(105） | 4/10 | 2/4 |
Note: 1)DBA/2 mice were injected with 1×105 cells and mice free of tumor at 4 w were challenged with 1×105 wild type P815 cells3 讨论
转入异基因型MHCⅡ类基因后能够引起有效的抗肿瘤反应，尽管已有报道［5］，但对其详细作用机理目前尚没有很好的解释。我们推测：异基因型MHC Ⅱ分子介导的反应可分成2个阶段。第1阶段，T细胞识别和杀伤的是表达异基因MHCⅡ分子的肿瘤细胞，是一个典型的同种异体识别(Allorecognition)排斥反应［6］；在第2阶段，T细胞必须识别和杀伤不表达MHCⅡ分子的肿瘤细胞，可能是一个正常的T细胞激活反应，即CD4+记忆性T细胞提供CD8+T细胞活化的必需因子，放大原本较低的肿瘤特异性反应，而后者的激活可介导肿瘤细胞的杀伤。
另一方面，转入异基因MHC Ⅱ 类基因可以使肿瘤细胞异种化(Xenogenization)，从而更容易被机体的免疫系统所识别。Lake等报道的相关识别(Associative recognization)指出：位于同一细胞表面的不同分子是由免疫系统共同加工提呈的。在我们的实验体系中，T细胞识别转入的抗原性较强的MHC Ⅱ 类分子的同时，也可能识别同一细胞上相对较弱的肿瘤相关抗原，从而引起针对P815细胞的免疫反应［7］。
根据近几年的文献报道，将MHCⅡ类基因转导至肿瘤细胞如：小鼠纤维肉瘤、小鼠黑色素瘤细胞或小鼠白血病细胞系中，都可以降低其致瘤性并且提高其免疫原性［4，5，8，9］。根据转入的MHC Ⅱ类基因的型以及瘤细胞的不同，可以将它们分成2大类：即异基因和同基因型MHCⅡ类基因转染。由于这些实验是在不同的实验条件下进行的，因此很难比较它们的作用效果。在本实验中，我们选用小鼠的肥大细胞瘤细胞系P815，分别将小鼠的IAk和IAd基因转移至其中，构建了异基因和同基因MHC Ⅱ基因转染的模型，并发现异基因型优于同基因型。这一结果的获得，对临床选择何种MHCⅡ类基因转移具有一定的指导意义。众所周知，临床中MHC配型是非常繁琐的事情，选择相配的MHC相当困难。我们的实验结果提示：在应用MHC Ⅱ类基因转移治疗恶性肿瘤的实践中，异基因型比同基因型MHCⅡ类基因具有更大的优越性。
作者简介：隋拥君，女，29岁，博士，助理研究员，主要研究方向
为肿瘤基因治疗和实验血液学；
唐佩弦，男，71岁，博士生导师，研究员，主要研究方向
为肿瘤基因治疗和实验血液学
参考文献：
［1］Rosato A,Zambon A,Milan G. CTL response and protection against P815 tumor challenge in mice immunized with DNA expressing the tumor-specific antigen P815A.Hum Gene Ther,1997;8(12):1451
［2］Townsend A,Bodmer H.Antigen recognition by class I restricted T lymphocytes.Annu Rev Immunol,1989;7:601
［3］Germain R,Malissen B.Analysis of the expression and function of class Ⅱ major histocomatibility complex encoded molecules.Annu Rev Immunol, 1986;4:251
［4］Ostrand-Rosenberg S,Thakur A,Clements V.Rejection of mouse sarcoma cells after transfection of MHC class II genes. J Immunol,1990;144:4068
［5］Leach D,Callahan G.Fibrosarcoma cells expressing allogeneic MHC class II antigens induce protective antitumor immunity. J Immunol,1995;154:738
［6］Sherman L,Chattopadhyay S.The molecular basis of allorecognition. Annu Rev Immunol,1993;11:385
［7］Lake P,Mitchison N A.Associative control of the immune response to cell surface antigens.Immunol Commun,1976；5：795
［8］Ostrand-Rosenberg S,Basker S,Patterson N et al.Expression of MHC class II and B7-1 and B7-2 costimulatory molecules accompanies tumor rejection and reduces the metastatic potential of tumor cells.Tissue Antigens ,1996;47:41
［9］James R,Edwards S,Hui K et al.The effect of class II gene transfection of the tumourigenicity of the H-2K-negative leukaemia cell line K36.16.Immunology, 1991；72：213
收稿日期：1998-07-09
修改日期：1998-09-28