自身抗原La融合蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫学鉴定

自身抗原La融合蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫学鉴定

中国免疫学杂志 2000年第4期第16卷 免疫学技术与方法

作者：邓安梅　仲人前　陈孙孝　施笑梅　孔宪涛

单位：邓安梅（第二军医大学附属医院临 床免疫中心，上海 200003）；仲人前（第二军医大学附属医院临 床免疫中心，上海 200003）；陈孙孝（第二军医大学附属医院临 床免疫中心，上海 200003）；施笑梅（第二军医大学附属医院临 床免疫中心，上海 200003）；孔宪涛（第二军医大学附属医院临 床免疫中心，上海 200003）

　　中国图书分类号　R392.11

　　系统性自身免疫病患者血清中有多种针对核蛋白复合物(RNP)的自身抗体，它们在发病机制 中的作用尚不清楚。

　　抗La抗体常出现在许多系统性自身免疫病患者的血清中，如系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综 合征(SS)、和新生儿狼疮(NLE)。因此，我们克隆了L a cDNA，并在大肠杆菌中表达其融合蛋白，经免疫印迹法证实其抗原性，以期进一步分析其 分子结构及临床意义。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料　PGEX-2T质粒；JM109菌株；La cDNA clone pLa^*(本中心所 存)；TaqDNA多聚酶，EcoRI内切酶，BamHI内切酶，T4DNA连接酶;Rnasin;IPTG(Promega) ;QINprep Plasmid Miniprep Kit,DNA extraction Kit(Promega)。

　　1.2　用PCR方法扩增La cDNA　设计用于特异性扩 增La cDNA的一对引物。5’端和3’端分别添加了BamHI内切酶和EcoRI内切酶位 点序列，交中国科学院细胞研究所合成纯化。

　　5’端引物为：

　　5’AAGGGATCCATGGAGGAATCTGTAAACCAA　3’，

　　BamHI

　　3’端引物为：

　　5’AAAGAATTCTCAAATGATTTATTTAGT　3’。

　　EcoRI

　　PCR反应扩增条件：94℃ 4 min;93℃ 30 s,48℃ 30 s;72℃ 2.5 min，共3个循环 ；93℃ 30 s,62℃ 30 s;72℃ 2 min，共25个循环；72℃ 8 min。扩增产物经溴化 乙啶-琼脂糖凝胶电泳检测。将纯化的PCR扩增产物 用Sanger双脱氧链末端终止法测序。

　　1.3　重组质粒的构建与转化　将经过D NA测序鉴定的纯化的PCR扩增产物定向插入PGEX-2T。转导入宿主菌JM109，提取质粒，经 BamHI，EcoRI双酶切后，再用1%琼脂糖凝胶电泳观察酶切 产物和PCR产物，PGEX-2T，重组质粒的条带。

　　1.4　重组质粒在大肠肝菌的表达与鉴定　挑取上述经鉴定后的重组克隆于L G/Amp培养液37℃振摇过夜，次日1∶100稀释转种于新的LB/Amp培养液中，37℃振摇培养约3 h(OD值约为0.5～0.6)，然后加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，诱导3 h，定时取样。煮沸 裂菌后离心取上清。取10 μl与标准蛋白，未经诱导的菌体蛋白同时进行SDS-PAGE电泳， 经考马斯亮蓝染色，分析电泳条带。

　　1.5　免疫印迹法分析重组融合蛋白的抗原性　重组蛋白经SDS-PAGE电泳后 进行转印。将转印后的NC膜剪成条带，用含3% BSA的PBS(pH7.4)封闭1 h。依次加入Ro 标准 血清，HRP标记的兔抗人IgG抗体，3，3-二氧联苯胺底物。同时用正常血清作阴性对照。

　　2　结果

　　2.1　La重组质粒的构建　PCR产物的琼脂糖凝胶电泳显示，在分子量约为1. 2 kb处可见清晰的特异性扩增条带。DNA测序结果表明它与EMBL库中检索到的一致，是La基因 的精确拷贝。用双酶切法证实质粒载体中含在以正确方向插入，符合预期长度的目的基因 (图1)。

图1　La重组质粒酶切电泳图

　　Fig.1　Recombinant plasmid La-PGEX-2T after enzyme digestion

　　Note:1.recombinant plasmid La-PGEX-2T;2.La PCR product;3.DN A marker

　　2.2　重组融合蛋白的表达、鉴定　经IPTG诱导表达的菌体蛋白经8% SDS-P AGE电泳，考马斯亮蓝染色后，在约73 kD处有一浓染蛋白条带，而未经IPTG诱导的菌体蛋白 在此处呈阴性(图2)。免疫印迹的结果表明，重组融合蛋白具有La抗原性，与标准抗La阳性 血清反应阳性，而与正常人血清反应阴性(图3)。

图2　La融合10%SDS-PAGE电泳图

　　Fig.2　10% SDS-PAGE of La-GST fusion protein

　　Note：1.the lysis of E.coli JM109 cont aining

　　recombinant plasmid La-PGEX-2T;2.standard protein marker;

　　3.the lysis of E.coli JM109 containing plasmid PGEX-2T

图3　免疫印迹反应结果

　　Fig.3　Immuneblotting of recombinant protein

　　Note:1～4.the lysis of E.coli JM109 containing La-PGEX-2T;

　　5.t he lysis of E.coli JM109 containing PGEX-2T.

　　Sera:1,5.standard anti-La serum;2.anti-La positive patient's seru m;

　　3.standard anti-Ro serum;4.standard anti-U₁ RNP serum

　　3　讨论

　　本研究设计引物时添加了BamHI、EcoRI双酶切位点，得以将La cDNA定向插入表达载体PGEX -2T，避免了DNA插入的反向、串联或自联等问题。产生的PGEX-2T重组子经双酶切和DNA琼 脂糖凝胶电泳，证实其中含有预期目的基因，为保证后续工作的准确性提供了依据。

　　选用PGEX-2T作为表达载体，其优点是：将目的基因与PGEX-2T定向克隆并导入大肠杆菌表 达，可产生La与GST的融合蛋白，分离纯化简便，可用谷胱甘肽亲合层析柱分离融合蛋白； 而 在GST和La之间有凝血酶酶切位点，在体外可切除GST而得到La抗原，可用于抗原表位研究， 消除GST对La抗原性的干扰。而细菌蛋白酶对重组蛋白降解减少，因而表达产量较高。

　　在SDS-PAGE电泳中，经IPTG诱导的含重组质粒的大肠杆菌JM109在近73 kD处出现大量蛋白 表达，考马斯亮蓝染色呈出浓染带，不含目的基因的大肠杆菌JM109在73 kD附近未有蛋白条 带，而含PGEX-2T空白载体的大肠杆菌JM109经IPTG诱导后出现大量蛋白表达，但位置在26 kD处，这与大肠杆菌含有的PGEX-2T表达的谷胱甘肽-S-转移酶有关。经免疫印迹法证实 ，本研究所得La融合蛋白具有La抗原性。

　　本课题受上海市启明星基金部分资助，编号94QB14002

　　作者简介：邓安梅，女，28岁，博士，主要研究临床免疫学；

　　孔宪涛，男，67岁，教授，博士生导师，从事临床免疫学研究