纤维母细胞生长因子的提纯及抗血清的制备

纤维母细胞生长因子的提纯及抗血清的制备

中国免疫学杂志 2000年第8期第16卷 分子与细胞免疫学

作者：孙庆霞　王晓红　弓长丽　付平平　王维忠

单位：孙庆霞（吉林省临床检验中心,长春130021）；王晓红（吉林省人民医院检验科，长春130021）弓长丽（吉林省人民医院检验科，长春130021）；付平平（白求恩医科大学第三临床学院，长春130031）；王维忠（白求恩医科大学第三临床学院，长春130031）

　　中国图书分类号　R392.1

　　1974年Grospodarowicz从牛垂体中提纯出碱性成纤维母细胞生长因子(basic Fibroblast Growth Factor，bFGF)后，其临床意义得到广泛的重视。目前，bFGF被认为是某些恶性肿瘤诊断的一项敏感性指标，具有操作简便、特异性高等优点。为建立bFGF诊断试剂盒，我们将Grospodarowicz的方法稍加改进，从牛脑提取了bFGF，并制备了抗bFGF血清。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料　牛脑购自长春市屠宰厂；肝素-Sepharose、CM-Sephadex C-50购自Pharmacia公司；低分子量标准蛋白购自上海东风生化试剂公司；丙烯酰胺、N、N-亚甲基丙烯酰胺、溴酚兰、过硫酸铵、考马斯亮蓝、十二烷基磺酸钠购自Serva公司。

　　1.2　方法

　　1.2.1　提纯抗原　先将新鲜牛脑组织匀浆，用硫酸铵分步沉淀蛋白，再进行CM-Sephadex C-50离子交换层析和肝素-Sepharose亲和层析，收集活性组份。

　　1.2.2　抗血清的制备　将bFGF抗原分6次免疫雄性新西兰白兔，首次100 μg抗原加福氏完全佐剂，后脚掌皮内多点注射，第2至第6次用100 μg抗原加福氏不完全佐剂，背部皮内多点注射，间隔2w，末次免疫7 d后颈动脉放血，分离血清备用。

　　1.2.3　抗原鉴定　将活性组份除盐、浓缩后用12%聚丙烯酰胺凝胶按常规方法进行聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳，以判定等电点，将活性组份用12%聚丙烯酰胺凝胶按常规方法进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，以测定分子量并鉴定纯度，采用lowry氏法测定蛋白质浓度,蛋白质活性用人脐静脉内皮细胞测定。

　　1.2.4　抗体的鉴定　采用免疫双向扩散分析法。

　　2　结果

　　2.1　牛脑bFGF的鉴定　纯化样品PAGE图经考马斯亮蓝G-50染色显示，所提取的蛋白在上样位置没动，而同时分析的牛血清白蛋白有泳动，因凝胶体系的pH=8.9，可推断所提纯蛋白PI＞8.9。

　　纯化样品SDS-PAGE图经考马斯亮蓝G-50染色显示，所提取蛋白为2条密切相关的带，分子量分别为16 400、16 000，以16 400组分为主，16 000组分含量很少。

　　2.2　抗血清的鉴定　制备的抗血清与提纯的bFGF及基因重组的bFGF反应，形成沉淀线，而与免疫前的兔血清不形成沉淀线。

　　3　讨论

　　PAGE结果显示：bFGF的PI＞8.9，SDS-PAGE结果显示：我们提纯的牛脑bFGF含有2种组分，这和以往的报道基本吻合，但我们提纯的牛脑bFGF以高分子量组分为主，低分子量组分很少，提示两组分子含量差异一部分是原组织中存在的，也有一部分是在提纯过程中引入的。

　　bFGF分子量小，抗原性偏低，国外制备多克隆抗体均采用人工合成含前10至20个氨基酸的小肽，再连接到牛血清白蛋白上，增大分子量，借以增加抗原性，我们以提纯bFGF为抗原采用小剂量皮内多点注射法，免疫新西兰白兔，经多次加强，获得了效价适中的抗体，制备的抗血清与提纯的bFGF及基因重组的bFGF反应，形成沉淀线，而与免疫前的兔血清不形成沉淀线，经Westren blot实验证明:与肠癌组织中的bFGF反应特异，效果良好，说明我们制备的抗血清特异性较好。

　　作者简介：孙庆霞，女，35岁，硕士，副主任检验师，主要从事临床检验工作

　　指导教师：王维忠，男，58岁，教授，博士生导师，从事临床免疫学研究

［收稿1999-11-27　修回s］