pS2融合蛋白的原核表达及其性质鉴定

pS2融合蛋白的原核表达及其性质鉴定

中国免疫学杂志 2000年第11期第16卷 分子与细胞免疫学

作者：刘彩云　杨蔚　孙素莲　丁桂风

单位：刘彩云 杨蔚 孙素莲 丁桂风(北京医科大学临床肿瘤学院北京市肿瘤防治研究所，北京100034)；丁桂风(北京医科大学免疫学系，北京 100083)

　　关键词: pS2融合蛋白；原核表达；温度诱导；免疫组织化学

　　摘　要　目的：获得pS2融合蛋白。方法：RT-PCR法从乳腺癌组织中扩增pS2片段，定向克隆到PMS-31b载 体上，重组质粒PMS-pS2转化温度敏感型细菌POP2136，使之高效表达融合蛋白MS2-pS2。结果：免疫组织化学试验(IHC)结果表明：纯化的融合蛋白MS2-pS2能 与抗pS2进口单抗特异反应。酶联免疫吸附试验(ELISA)及Western blotting试验表明：MS2 -p S2能与pS2 C端31个氨基酸合成肽抗血清特异反应。以此融合蛋白为免疫原得到的抗血清可 用于免疫组织化学分析。结论：pS2融合蛋白表达是正确的，亦为进一步研究pS2生物学功能及制 备抗pS2单抗奠定了基础。

　　中国图书分类号　R392-33

Expression in prokaryote and identification of pS2 fusi on protein

LIU Cai-Yun,YANG Wei,SUN Su-Lian et al.

　　(The School of Oncol o gy,Beijing Medical University,Beijing Institute for Cancer Research,Beijing 100034)

　　Abstract　Objective:To experss pS2 fusion protein.Methods: pS2 fragment was amplificated by RT-PCR from human breas t cancer tissue.Recombinant plasmid PMS-pS2 was constructed by inserting a Eco RI/BamHI fragment from pS2 cDNA into expression vector PMS-31b and was transferred into competent E coli P OP2136 cells containing a temperature-sensitive mutant.MS2-pS2 fusion protein was synthesized in POP2136 at 42℃.Results:The purified MS2-pS2 fusion protein recognized s pecifically antiserum raised against the synthetic peptide corresponding to C-e nd 31 amino acids of deduced pS2 protein sequence in the ELISA and Western blot ting.The fusion protein reacted with the pS2 monoclonal antibody (DAKO product ) in immunohistochemistry.The MS2-pS2 fusion protein was served as immunogen,t h e antiserum was effective immunohistochemically on formalin-fixed rountinely pr ocessed section of human breast tumors.Conclusion:The pS2 fusion protein expressed in prokaryote cells was correct and estabilished the basis for preparating anti-pS2 monocl onal antibody.

　　Key words　pS2 fusion protein　Prokaryotic expression　Tem perature induction　Immunohistochemistry(IHC)

　　pS2基因是三叶草因子家族(Trefoil factor family，TFF)中的第一成员， 首先是在人乳腺癌细胞系MCF7中借助雌激素调节而发现的^［1］，现命名为TFF1 ^［2］。 pS2基因定位于第21号染色体，含有3个外显子和2个内含子，编码一含有信号肽 的84个氨基酸的多肽，成熟后为一60氨基酸残基的分泌型胞外多肽^［3］。 pS2在胃 肠道粘膜修复中起作用，但临床研究发现， pS2(+)患者其无病生存期(RFS)和总生存期(OS) 较pS2(-)患者明显高，持续 pS2表达的乳腺癌患者预后好^［4］，可作为乳腺癌抗雌 激素治疗反应的预测指标。本文构建PMS-pS2重组质粒转化大肠杆菌POP2136高效表达MS2- pS2融合蛋白，对pS2性质研究及制备抗pS2单克隆抗体以检测组织中pS2蛋白表达水平奠定了 重要基础。

　　1　材料与方法

　　1.1　RT-PCR　按已知pS2序列合成pS2上下游引 物^［5］，上游引物 为5’CGGCGAATTCCAGACAGAGACG-

　　TGTACA 3’下游引物为5’CGGCGGATCCTTAAAATTCACACT CCTC CTC 3’(赛百盛公司合成)。从乳腺癌组织中提取RNA并逆转录成cDNA，以此为模板，加入内 对照β-actin、pS2上下游引物进行PCR ，扩增条件为94℃变性4 min，94℃30 s，55℃35 s，72℃40 s，30个循环，72℃延伸1 0 min。

　　1.2　PMS-pS2重组质粒的构建　RT-PCR产物中提纯的pS2片段，PM S-31b-ER重组质粒(本室构建)均经BamHI/EcoRI(GIBCO产品)37℃双酶切过夜，酶切产物纯 化后，二者以4∶1浓度加入T4DNA连接酶(GIBCO产品)23℃孵育3 h。

　　1.3　PMS-pS2重组质粒转化及融合蛋白表达

　　1.3.1　PMS-pS2重组质粒转化　转化方法见文献［6］。

　　1.3.2　MS2-pS2融合蛋白表达及纯化　将转化后的POP2136铺到含Amp⁺ 的 LB平板上，30℃过夜，挑几个单克隆于2 ml LB/Amp⁺中30℃振摇过夜，以1∶40倍稀释后 ， 继续振摇2.5 h，将温度迅速升到42℃诱导4～5 h。将诱导菌与非诱导菌，进行15%SDS -PAGE分析。融合蛋白的纯化按文献［6］。

　　1.4　MS2-pS2融合蛋白的性质鉴定

　　1.4.1　ELISA试验　用pS2 C端31氨基酸合成肽(北大生命科学中心合成) 包被ELISA酶标板，先将不同浓度的MS2-pS2融合蛋白与此合成肽抗血清(本室自制)于37 ℃孵育1 h或4℃过夜，再加到酶标板中，常规ELISA试验。

　　1.4.2　免疫组化试验(IHC)　预先将MS2-pS2融合蛋白分别与抗pS2进口 单抗(DAKO产品)及抗pS2抗血清37 ℃孵育1 h或4℃过夜，再进行常规免疫组化。

　　1.4.3　Western blotting　诱导菌经15%SDS-PAGE后，将其蛋白转到硝 酸纤维素膜上，用3%BSA37℃封闭0.5 h，将膜分别在无关抗血清及抗pS2抗血清37℃孵育1 h，含0.5%triton x-100的PBS洗3次，加入羊抗小鼠酶标结合物37℃孵育1 h，洗3次，含0.03%H₂O₂的DAB为底物。阴性对照只加PS2 抗血清或只加羊抗小鼠酶标结合物。

　　2　结果

　　2.1　RT-PCR结果　从图1中可以看出，在121 bp之上383 bp之下有一条清 晰条带，与pS2的180 bp分子量相符。

　　2.2　PMS-pS2重组质粒的鉴定　重组质粒经EcoRI/BamHI双酶切后，在4 k b及200 bp附近分别有1条带，与载体PMS-31b及pS2片段相吻合(图2)。

　　2.3　MS2-pS2融合蛋白表达及纯化　图3可以看出，诱导菌在18.4 kD 之上比非诱导菌多1条蛋白带，这与MS2-pS2预计分子量基本相符，诱导蛋白以包涵体的形 式存在，而裂解菌的上清中几乎没有；经纯化的MS2-pS2融合蛋白只有1条蛋白带。

　　2.4　Western blotting　图4中约18 kD附近有1条反应带，其它阴性对 照未出现条带，说明pS2融合蛋白能与抗pS2抗血清特异反应。

　　2.5　免疫组化试验(IHC)　图5中可以看出进口单抗进行的IHC中，胞浆 有很强的着色，而将pS2单抗或pS2抗血清与MS2-pS2融合蛋白在37℃一起孵育1 h再进行IHC试验时，胞浆几乎没有着色，这说明MS2-pS2融合蛋白能与进口抗pS2单抗、pS2 C-端合成肽多抗特异反应。

图1　pS2片段的RT-PCR扩增

　　Fig.1　The pS2 fragment amplificated by PCR

　　Note:Samples were run on a 1.5% agarose gel；1.pBR322 DNA/BstNl;2,3 both pS2 and β-actin primers on RT-PCR respectively

图2　PMS-pS2重组质粒酶切图谱

　　Fig.2　pS2 fragment was shown from PMS-pS2 recombinant plasmid digested by EcoRl-BamHl

　　Note:Samples were run on a 1% agarose gel；1,4.λ DNA/HindⅢ,pBR322DNA/Bs tNl;2,3.PMS-ER,PMS-pS2 were digested by EcoRⅠ-BamHⅠ

　　3　讨论

　　由于MCF-7中pS2蛋白含量低及pS2分子的低 分子量给pS2的获得带来很大困难，本文以RT -PCR扩增pS2片段，42℃诱导含PMS-pS2重组质粒的温度敏感型细菌POP2136，可大量获得 含pS2全片段的融合蛋白。Chadwich等制备重组蛋白的目的是对其结构研究^［7］，而对其生物学性质未作报道。本文先将pS2融合蛋白与进口pS2单 抗预先于37℃孵育1 h后，再 进行IHC，以鉴定MS2-pS2融合蛋白与进口单抗的反应性。由于进口pS2单抗只 能用于冰冻切片、石蜡切片IHC，而不能用于ELISA、免疫印迹研究。因此本文 用抗pS2C-端31氨基酸小鼠多抗血清 替代进口单抗，这些试 验结果均证明了pS2融合蛋白的正确性及特异性。pS2全片段作免疫原可 得到抗pS2不同表位的单克隆抗体建立双抗夹心法测患者血清中pS2表达水平 比IHC 更快速、方便、简单，也可以对pS2生物性质研究提供有力的依据。本文制备pS2 融合蛋白为制备抗pS2单克隆抗体以检测肿瘤患者pS2蛋白表达水平奠定了基础。

图3　MS2-pS2 在细菌裂解液中的溶解性分析

　　Fig.3Analysis and purification of fusion protein MS2-pS2 synthesized in POP2136

　　Note:Samples were run on a 15% SDS-PAGE,proteins were stained with cooma ssie blue.1.protein molecular weight stand ard;2,3.total cell lysate of cells harboring PMS-pS2 grown at 30℃、42℃ respec tively;4,5.the supernatant and sediment of bacteria lysates grown at 42℃;6.th e purified MS2-pS2

图4　融合蛋白MS2-pS2的免疫印迹分析

　　Fig.4Western blotting analysis of fusion protein MS2-pS2

　　Note:1,2.filters were reacted with irrelevant mouse antiserum,mouse seru m immunized with the C-terminal peptide;3,4 controls were performed in the abse nce of the immune serum,the goat antimouse immunoglobulins coupled to HRP respe ctively

图5　人乳腺癌石蜡切片pS2免疫组分化(125×)

　　Fig.5pS2 immunohistochemical staining in human breast cancer(125×)

　　Note:Without(A) and after preincubation of the pS2 McAb with the fusion p rotein MS2-pS2 at 100 μg/ml(B)

　　本课题受北京市科委资助(批准号：953304104)

　　作者简介：刘彩云，女，30岁，硕士，助理研究员；指导教师：孙素莲，女，65岁，教授

　　参考文献

　　1，Polshakov V I,Williams M A,Gargaro A R et al.High-resolution s ou tion structure of human pNR-2/pS2;a signal trefoil motif protein. J Mol Biol,1 997;267:418

　　2，Seib T,Blin N,Hilgert K et al.The three human trefoil gene Tff1,Tff2 and Tff3 are located within a region of 55 kb on chromsome 21q22.3. Genomics,1997; 40:200

　　3，May F E B,Westley B R.Identification and characterization of estrogen-regul ated RNAs in human breast cancer cells.J Bio Chem， 1998;263:12901

　　4，Thompson A M,Eltor R A,Hawkins R A et al.pS2 mRNA expression adds progno s tic information to node status for 6-year survival in breast cancer.Br J Canc er,1998;77:492

　　5，Morik,Fujii R,Kida N et al.Complete primary structure of the human estro gen responsive gene(pS2) product.J Biochem,1990;107:73

　　6，刘彩云，寿成超，孙素莲et al.P⁵³融合蛋白的原核表达及其单克隆抗体的 制备.解剖学报，1999；30(1)：61

　　7，Chadwich M P,May F E B,Westley B R.Production and comparison of mature sing led omain'trefoil' peptides pNR-2/pS2 cys⁵⁸ and pNR-2/pS2 ser⁵⁸ .Bioc hem J,1995;308:1001

［收稿1999-10-18］