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中国免疫学杂志 2000年第10期第16卷 临床免疫学
作者：傅晋翔 张宏 虞斐 张学光
单位：傅晋翔（苏州医学院免疫教研室，苏州215007）；张宏（苏州医学院免疫教研室，苏州215007）虞斐（苏州医学院免疫教研室，苏州215007）；张学光（苏州医学院免疫教研室，苏州215007）
关键词: 再生障碍性贫血；细胞因子；临床转归
摘 要 目的：研究再生障碍性贫血(AA)患者外周及骨髓血IL-2、sIL-2R、IL-3、IL-6、IL-8、TNF-α、SCF和IFN-γ含量变化与骨髓造血功能的改变及临床转归的关系。方法：采用夹心酶联免疫吸附法检测AA外周及骨髓血中细胞因子含量的动态变化。结果：1.治疗前患者血浆及骨髓中IL-2、sIL-2R、IL-3、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ浓度与正常对照组均有不同程度的升高，以IL-2、IL-8、TNF-α和IFN-γ水平升高更明显（P ＜0.01），SCF则无改变；2.急、慢性AA(sAA, cAA)治疗前后细胞因子浓度的比较发现cAA血浆及骨髓IL-3高于sAA（P ＜0.05）,而IL-2、IL-8、TNF-α和IFN-γ浓度则以sAA升高明显（P ＜0.01）；3.经治疗有效的患者几种因子均有明显的降低（P ＜0.05），尤以IL-2、IL-8、TNF-α和IFN-γ下降明显（P ＜0.01）。结论：IL-2、IL-8、TNF-α和IFN-γ与AA的发生、发展有关。
中国图书分类号 R556.5 R392.112
Evaluation of serum and bone marrow positive- and negative- hematopoietic growth factors in patients with aplastic anemia and its implication on clinical outcome
FU Jin-Xiang，ZHANG Hong，YU Fei
（Institute of Immunology of Suzhou Medical College,Suzhou 215001）
Abstract Objective:To investigate the relationship between the levels of interleukin-2, 3, 6, 8, soluble interleukin -2 receptor (sIL-2R), steel factor(SCF) tumor necrosis factor-α(TNF-α)and interferon-γ (IFN-γ) in serum and bone marrow and hematopoiesis in patients with aplastic anemia(AA) and its implication on clinical outcome. Methods: Using enzyme-linked immunoadsorbent assay(ELISA), have studied pre- and post-treatment serum and bone marrow level of IL-2, IL-2R, IL-3, IL-6, IL-8, SCF, TNF-α and IFN-γ in 37 patients with AA. Results: In compared with controls, the pretreatment levels of IL-2, sIL-2R,IL-3, IL-6, IL-8 , TNF-α and IFN-γ in serum and bone marrow were slightly higher in patients with AA. But the levels of IL-2, IL-8 and IFN-γ were much higher in these patients. The level of SCF was unchanged. Serum and bone marrow IL-3 level were much higher in patients with chronic AA(P＜0.05), otherwise higher level of IL-2, IL-8, TNF-α and IFN-γ levels was always seen in patients with serious AA(sAA, P＜0.01). After successful treatment, the levels of cytokines detected in serum and bone marrow tended to return to normal level(P＜0.05), and decrease of IL-2, IL-8, TNF-α and IFN-γ levels were much more significant(P＜0.01). Conclusion: The result of the study on AA showed that interdependent role of IL-2, IL-8, TNF-α and IFN-γ on pathogenesis and developing of AA.
Key words Aplastic anemia Cytokines Clinical outcome
造血干细胞的缺乏导致造血功能衰竭一直被认为是再生障碍性贫血（AA）的主要病变，但涉及的确切机制至今尚未完全阐明。最初应用体外造血细胞集落形成技术也证明AA时其骨髓各类型造血干/祖细胞均有明显的减少或缺如［1］。业已表明，机体骨髓的造血功能受造血微环境中的基质细胞、免疫细胞和一系列细胞因子的调控。激活的免疫细胞可
产生多种细胞因子，不同种类和浓度的细胞因子对处于不同阶段的造血细胞发挥不同的作用。目前认为造血正、负性细胞因子分泌紊乱在AA发病中起重要的作用［2］。本文应用夹心酶联免疫吸附法（ELISA）分析了37例AA血清（部分骨髓）中白介素-2、2R、3、6、8（IL-2、sIL-2R、3、IL-6、IL-8）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、干细胞因子（SCF）和γ-干扰素（IFN-γ）水平变化，并对其临床意义进行初步探讨。
1 材料与方法
1．1 研究对象 1997年9月至1999年9月，59例全血细胞减少患者入院后常规进行血常规、生化、溶血、染色体（R显带）及骨髓细胞学检查，37例符合AA的诊断标准［3］。其中急性AA （sAA）13例，I型8例，II型5例；慢性AA（cAA）24例。女性20例，男性17例，中数年龄32岁（4～78岁），病程8 d～18年。患者入院时及治疗后45～60 d分别抽取新鲜血液5 ml，EDTA 抗凝，其中25例同时取骨髓。标本1 500 r/min离心15 min后取上清，无菌分装，置-20℃冷冻待用。，其中27例进行了随访，中数随访时间为5.6个月（4～16个月）。
1．2 治疗方法 所有患者均采用雄激素丙睾50～100 mg/d或康力龙4～12 mg/d（其中有7例口服安雄120 mg/d）加环孢菌素（CyA，瑞士Sandoz产品）静脉用量3～5 mg/kg，维持6 h，10 d为一疗程，间歇10 d后，进行下一个疗程，2～3个疗程后改为口服CyA的治疗方案，疗程3～6个月（中位数4.6个月）。疗效判断按血液病的诊断和疗效标准［3］。出院后仍用康力龙或安雄加CyA维持，27例随访者中有15例CyA使用超过5个月，其余分别在出院后1～3个月停药，仅用康力龙或安雄加再障生血片维持。
1．3 材料和实验方法 IL-2、IL-2R、IL-3、IL-6、IL-8、SCF、TNF-α及IFN-γ检测试剂盒均购自晶美公司。各因子的检测采用常规ELISA法，简述如下：将标本和已稀释的不同浓度的标准品各100 μl至相应各孔， 90 min后洗板。然后加生物素标记的二抗100 μl， 60 min，洗板后分别加酶联物100 μl（零孔除外），作用30 min，洗板后每孔加显色剂A、B各50 μl，反应15 min后加终止液50 μl，即刻在酶标仪450 nm处读取OD值。以标准OD值绘制标准曲线。外周血正常对照均为体检合格的成人，骨髓为非血液系统疾病正常骨髓标本共18例。
1．4 统计学方法 采用t′检验及单因素回归分析，组间比较用秩和检验，数据用
2 结果
2．1 患者治疗前后血象的改变 有16例患者入院时有不同程度的发烧，18例有不同部位的皮肤、消化道或眼底出血。治疗前后血象改变详见表1。经治疗5例sAA基本缓解，3例明显进步；4例cAA基本缓解，8例明显进步。随访的27例病人中4例仍然处于基本缓解状态，7例较出院时稍差，但血红蛋白仍在80 g/L以上，随访时间为4～16个月。
表1 入院前后患者血象变化
Tab.1 Blood appearance of the AA patients before and after treatment
| Ergency AA(n=13) | chronic AA(n=24) | |||||||
| ANC（×109） | Hb（g/L） | BPC（×109） | RET（×109） | ANC（×109） | Hb（g/L） | BPC（×109） | RET（×109） | |
| Pretreatment | 0.44±0.52 | 7.85±4.65 | 3.55±4.75 | 8.45±3.55 | 1.25±1.95 | 5.44±4.5 | 2.55±1.95 | 14.84±3.75 |
| Posttreatment | 1.75±1.87 | 8.85±2.85 | 5.50±3.25 | 12.52±8.68 | 2.45±1.18 | 7.85±6.25 | 4.25±3.70 | 16.91±9.35 |
note:ANC:absolute neutrophil count;Hb:hemoglobin;BPC:platelet;RET:absolute reticulocyte
表2 37例再生障碍性贫血患者治疗前后IL-3、IL-6、IL-8及IFN-γ浓度变化(pg/ml)
Tab.2 The variety of IL-6、IL-8 and IFN-γ levels in the AA patients pre and posttreatment(pg/ml)
| Pretreatment | IL-2 | IL-2R | IL-3 | IL-6 | IL-8 | IFN-γ | TNF-α | SCF |
| sAA PB | 578.42±214.53 | 185.90±45.85 | 467.27±320.65 | 19.62±18.84 | 76.42±30.58 | 65.73±52.58 | 35.25±26.33 | 968.52±338.25 |
| sAA BM | 608.13±245.47 | 203.42±77.33 | 507.49±310.24 | 22.65±15.14 | 89.19±36.23 | 87.45±43.25 | 47.08±31.45 | 1 105.21±352.4 |
| cAA PB | 214.70±164.93 | 162.90±40.08 | 527.45±356.25 | 23.55±16.40 | 58.33±18.50 | 45.46±36.28 | 34.40±27.70 | 985.35±289.35 |
| cAA BM | 258.67±144.85 | 189.63±67.39 | 534.35±280.54 | 25.10±17.55 | 69.35±25.45 | 51.56±33.45 | 35.53±30.50 | 988.85±308.53 |
| Posttreatment | ||||||||
| sAA PB | 448.62±354.26 | 151.40±71.35 | 387.47±214.25 | 15.02±13.30 | 36.04±27.47 | 29.88±30.50 | 19.35±22.53 | 920.25±284.25 |
| sAA BM | 435.82±389.15 | 173.54±85.06 | 491.50±375.48 | 18.15±15.35 | 41.39±26.45 | 24.40±37.33 | 28.15±26.40 | 1 048.41±381.30 |
| cAA PB | 189.45±214.21 | 134.43±53.13 | 384.54±312.75 | 18.33±13.10 | 37.63±32.45 | 29.35±26.28 | 18.33±17.82 | 963.75±331.25 |
| cAA BM | 212.33±232.73 | 144.76±78.30 | 405.35±281.23 | 21.36±12.51 | 38.74±29.53 | 31.36±28.58 | 21.22±24.44 | 1 015.33±291.35 |
| Follow-up | ||||||||
| sAA PB | 512.33±308.73 | 164.33±52.95 | 372.31±234.43 | 16.43±16.52 | 39.33±24.82 | 32.06±24.34 | 21.13±20.63 | 952.33±246.10 |
| sAA BM | 475.31±342.53 | 168.73±65.15 | 453.50±319.58 | 20.25±12.26 | 38.25±27.05 | 29.63±35.50 | 31.76±27.48 | 992.63±356.36 |
| cAA PB | 253.08±189.32 | 154.23±43.28 | 375.54±292.40 | 15.08±11.15 | 40.33±28.83 | 31.43±25.28 | 20.63±14.62 | 946.85±352.60 |
| cAA BM | 258.18±207.45 | 144.75±50.30 | 387.95±266.73 | 20.536±15.38 | 43.53±30.43 | 35.63±27.20 | 23.84±24.08 | 1 045.16±270.31 |
| Control PB | 89.22±79.58 | 109.22±52.50 | 455.31±271.54 | 17.85±13.55 | 9.77±7.12 | 12.36±4.15 | 10.36±6.33 | 1 010.5±354.25 |
| Control BM | 108.45±57.25 | 122.45±77.65 | 477.12±299.76 | 20.12±14.39 | 13.45±5.56 | 15.76±7.45 | 12.76±7.85 | 1 098.41±361.3 |
2．2 外周血和骨髓造血因子的改变 13例sAA和24例cAA治疗前后外周血和骨髓标本（sAA 8例，cAA 17例）IL-3、IL-6、IL-8浓度详见表2。结果表明：治疗前患者血浆及骨髓中IL-3、IL-6、IL-8浓度均有不同程度的升高,以IL-8水平升高最明显（P＜0.01），IL-3和IL-6与正常对照组无明显差别(P＞0.05)。急、慢AA血浆及骨髓SCF浓度则无明显改变；急、慢性AA治疗前后细胞因子浓度的比较发现,cAA血浆及骨髓IL-3高于sAA（P＜0.05），骨髓中IL-3、IL-6、IL-8浓度均高于外周血，IL-8浓度则以sAA升高明显（P ＜0.01）；经治疗有效的患者IL-8和IL-3明显降低（P ＜0.05）。
2．3 外周血和骨髓造血负性调控因子改变 37例AA患者TNF-α及IFN-γ检测结果见表2。结果发现AA患者血浆及骨髓中TNF-α和IFN-γ浓度均明显升高，与对照组相比差别明显（P ＜0.01）；骨髓中TNF-α和IFN-γ水平高于外周血，尤其是sAA骨髓中TNF-α和IFN-γ浓度较正常高约4倍，差别显著（P ＜0.01），统计分析提示AA患者外周血和骨髓中TNF-α和IFN-γ浓度升高与其疾病的严重程度呈负相关（r=0.890 7，P＜0.05）；治疗有效者该2种细胞因子均有明显下降。
2．4 IL-2和IL-2R含量的改变 IL-2和IL-2R是免疫反应过程中T淋巴细胞活化及增殖的重要因子。对37例AA血浆和骨髓IL-2测定发现，IL-2升高可见于急、慢性AA，并在sAA表现尤为突出（P ＜0.001），约为正常人群的6倍，但骨髓与外周血的浓度无明显区别，治疗后虽有一定程度的下降，但仍显著高于正常对照组。IL-2R浓度也升高，与对照组相比差别明显（P＜0.05），而骨髓中IL-2R水平略高于外周血，二者相比无差别。
2．5 感染与细胞因子变化的相关性 分析所测8种细胞的浓度是否与感染相关，结果发现当患者感染时，多种细胞因子发生相应改变。16例伴感染患者其骨髓和外周血IL-2、IL-2R、IL-8、 TNF-α及IFN-γ与无感染者相比明显升高（P ＜0.05），尤其以IL-2最为明显（P ＜0.01），骨髓及外周血各因子改变与无感染者相似，但急、慢性AA间感染者因子浓度变化无差异（P＞0.05）。各因子浓度与感染的关系见图1，图2。
2．6 造血正、负调控因子浓度改变与预后的相关性 对比治疗前后及部分随访患者血浆和骨髓各种因子浓度变化与临床疗效的关系，发现治疗有效者，IL-2、IL-8、TNF-α和IFN-γ水平均显著下降，其水平下降与患者外周血象的改善相关, 尤其是骨髓IL-2、TNF-α、IFN-γ浓度下降程度与疗效密切相关（r=0.892,P＜0.05），所有获缓解的患者，其血浆和骨髓血中IFN-γ和TNF-α均下降接近正常，而无效者的上述各因子水平与治疗前相比无明显变化。而作用于早期造血干/祖细胞的SCF则始终未见改变，与患者发病的快慢也无关。
图1 sAA有无感染时各种细胞因子的变化
Fig.1 The variety of cytokines in the serious AA patients with or without inflammatory
图2 cAA有无感染时各种因子的变化
Fig.2 The variety of cytokines in the chronic AA patients with or without inflammatory3 讨论
IL-3和IL-6是具有多种功能的造血调节因子，主要作用于早、中期造血干/祖细胞的增殖和分化［4，5］，IL-6也是T、B淋巴细胞增殖、分化以及活化的重要调节因子。而SCF则是作用于早期造血干/祖细胞主要细胞因子之一［6］。本文对13例sAA和24例cAA血清和骨髓样本检测结果发现，所有患者入院时IL-3均有不同程度的升高，尤以骨髓血升高较多，但与正常对照组相比无明显差别(P＞0.05)。cAA患者IL-3明显高于sAA（P＜0.05）。治疗后，IL-3较前有所下降，有效者则有较明显降低，其降低程度与血红蛋白升高有一定的相关性。IL-6的检测结果提示治疗前虽有不同程度的升高，但正常对照组无明显区别，推测AA患者IL-6变化可能与炎症或属非特异性改变有关，但与其它细胞因子一起参与激活免疫效应细胞对造血干/祖细胞的破坏。有意义的是所有患者在整个病程中，其血浆和骨髓中SCF浓度却无改变。Kojima等也曾报道［7］，AA患者与造血有关的因子中仅有SCF无明显变化。cAA患者由于长时间贫血，可非特异性地刺激骨髓基质细胞产生较多IL-3。我们的结果与其相同。
IFN-γ和TNF-α是主要由T细胞分泌造血负调节因子。它可阻止细胞周期的进行和促进CD34+细胞的凋亡。IFN-γ尚能够刺激骨髓造血细胞，其促进造血细胞凋亡的机制是能使CD34+细胞上调性表达Fas抗原，从而通过Fas/FasL使CD34+细胞发生凋亡。我们检测的结果发现37例AA中31例 IFN-γ和TNF-α均升高，尤其是骨髓中升高最为显著，P＜0.001，治疗有效者两者均明显下降，骨髓IFN-γ和TNF-α可接近正常，与无效者相比差别明显，P＜0.01，随访病情稳定者IFN-γ和TNF-α无明显改变，而复发者再次升高。可见IFN-γ和TNF-α在AA的发病过程中有重要作用。IL-8的主要功能是趋化中性粒细胞和T淋巴细胞向炎症部位集中，在正常情况下人体含量很少，而当机体存在炎症病变时，可刺激单核细胞或内皮细胞增加IL-8的分泌，同时IL-8还是负性造血调控因子，体外可显著抑制早期髓系祖细胞形成，其抑制效应与剂量相关，低浓度时与其它细胞因子如血小板因子-4、巨噬细胞炎性蛋白-1α及单核细胞活化因子等协同抑制CFU-GEMM和CFU-E的形成［8,9］。37例AA患者检测的结果发现治疗前无论有无感染，IL-8均有明显升高，sAA较cAA上升更多，P＜0.01。16例入院时伴有感染或发热的患者，IL-8升高更为明显，说明炎症时患者产生大量炎症因子，是IL-8升高的原因之一。而治疗后好转者IL-8水平明显下降。我们还发现34例AA患者的IL-8浓度升高，尤其是骨髓中IL-8水平升高更为显著，除本身所具有的负性造血调控外，可能与骨髓局部免疫损伤的严重程度有关，直接影响本病的转归。
IL-2主要由Th1细胞分泌，是T细胞活化的产物，同时也是其增殖和成熟的主要因子，IL-2R除Th1细胞表达外，还可在CD8+细胞、NK细胞及单核/巨噬细胞表面表达。本组12例sAA，19例cAA患者血浆及骨髓中IL-2显著升高，该种表现在sAA尤为明显，所有患者IL-2R水平均有不同程度的升高，提示AA患者发病时，其体内免疫反应异常。Schwinger等报道成功运用抗IL-2单克隆抗体治疗1例对多种免疫抑制剂耐药的sAA［10］。我们认为可能是由于体内自身反应性T细胞在异常升高的细胞因子作用，克隆性增生并产生针对自身造血干/祖细胞的细胞毒效应，抑制机体的造血功能。
多种细胞因子本身又是炎性因子，与机体的炎性反应有关。我们的结果也证实患者发热或有明显感染病灶时，IL-2、IL-2R、IL-6、IL-8、IFN-γ和TNF-α均较无感染病灶者为高，以IL-2，IL-8、IFN-γ和TNF-α为显著，感染控制后仍然明显高于正常对照，说明多种因子参与了整个疾病发生和发展过程，是AA发病过程中具有特征性的改变，定期监测IL-2、IL-8、IFN-γ和TNF-α对了解疾病变化、判断预后有较好的临床意义。
本课题受国防研究项目资助（Y5573262）
作者简介：傅晋翔，男，39岁，副主任医师，副教授，主要从事再生障碍性贫血免疫致病机制的研究，现正在攻读血液免疫学博士学位；
张学光，男，48岁，教授，导师,长期从事抗肿瘤免疫和血液免疫的研究工作
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［收稿1999-12-02，修回2000-03-22］