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α-黑素细胞刺激素体外对星形胶质细胞产生NO和前炎性细胞因子的影响
中国免疫学杂志 2000年第12期第16卷 神经内分泌与免疫
作者：吴秀菊 田野苹 周正芳 郑玲莉 马施华
单位：第二军医大学免疫学教研室，上海200433
关键词: α-黑素细胞刺激素；星形胶质细胞；一氧化氮；前炎性细胞因子
摘 要 目的：研究α-黑素细胞刺激素(α-MSH)对LPS诱导星形胶质细胞产生NO和前炎性细胞因子的影响，探讨α-MSH的抗炎作用机制。方法：分别用LPS或α-MSH+LPS处理体外培养的大鼠脑星形胶质细胞，用Griess试剂测定NO, 以MTT显色法检测IL-1、IL-6和TNF-α, 采用半定量RT-PCR检测MIF mRNA表达。结果：体外培养的星形胶质细胞在LPS刺激下产生NO、IL-1、IL-6、TNF-α和表达MIF mRNA显著增高; 若同时给予LPS和α-MSH, 可明显降低NO、IL-1、IL-6和TNF-α的产生以及MIF mRNA表达。结论：提示α-MSH抑制星形胶质细胞产生NO和前炎性细胞因子与其抑制中枢神经系统炎症反应密切相关。
中国图书分类号 R392.12
Effects of α-melanocyte-stimulating hormone on the production of NO and proinflammatory cytokines in astrocytes in vitro
WU Xiu-Ju TIAN Ye-Ping ZHOU Zheng-Fang
（Department of Immunology, Second Military Medical University, Shanghai 200433）
Abstract Objective:In order to explore the anti-inflammatory mechanisms of α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH), the effects of α-MSH on the production of NO and proinflammatory cytokines in astrocytes induced by LPS were investigated.Methods:Rat brain astrocytes cultured in vitro were stimulated with LPS or given α-MSH with LPS stimulation. NO produced in astrocytes was tested with Griess reagent. IL-1, IL-6 and TNF-α secreted from astrocytes were examined by MTT assay. The expression of macrophage migration inhibitory factor (MIF) mRNA was examined with semiquantitative RT-PCR analysis.Results:The production of NO, IL-1, IL-6, TNF-α and the expression of MIF mRNA were significantly increased in astrocytes stimulated with LPS. If giving α-MSH with LPS stimulation, the production of NO, IL-1, IL-6, TNF-α and the expression of MIF mRNA were markedly decreased.Conclusion:It is suggested that the inhibitory actions of α-MSH on the production of NO and proinflammatory cytokines in astrocytes are related to the inhibitory effects of α-MSH on inflammation in central nervous system.
Key words α-melanocyte stimulating hormone Astrocyte Nitric oxide Proinflammatory cytokine
星形胶质细胞是脑内特化的免疫细胞，能够产生多种细胞因子，并具有吞噬和提呈抗原等功能，在中枢神经系统病理过程中起重要作用。α-黑素细胞刺激素(α-melanocyte-stimulating hormone, α-MSH)是一种分布广泛的内源性神经免疫调节肽，动物实验证实α-MSH可抑制多种急慢性炎症反应［1-3］，包括脑炎症反应［4］。α-MSH的抗炎机制研究表明，α-MSH可作用于外周炎细胞上的相应受体，直接抑制局部炎症反应，也可作用于中枢神经系统，进而调节外周炎症反应［5］，但是否涉及抑制占脑内胶质细胞大多数的星形胶质细胞产生各种炎症介质的报道很少。本实验研究了α-MSH对LPS诱导脑星形胶质细胞产生NO和前炎性细胞因子的影响，进一步从神经内分泌免疫调节角度探明α-MSH的抗炎作用机制。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和细胞株 α-MSH和LPS购自Sigma；MTT购自Amresco；B9杂交瘤细胞和L929细胞购自ATCC；RPMI1640培养基购自GibcoBRL。
1.2 星形胶质细胞的体外培养 取1日龄新生SD大鼠脑组织，剥除脑膜和血管，Hank′s液冲洗2遍，反复轻柔吹打制成细胞悬液，用含15%～20%NCS的DMEM高糖培养基(葡萄糖6 mg/ml)进行培养，第5天换液1次，第9天以机械振荡去除其它细胞，再以0.1%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化，换用含10%NCS的DMEM高糖培养基, 置37℃、5%CO2中培养,待细胞达90%以上接触，以胶质纤维酸性蛋白抗体经免疫细胞化学方法鉴定，星形胶质细胞纯度达99%以上。本实验中均使用培养2～4 w的星形胶质细胞。
1.3 星形胶质细胞培养上清的制备 用完全DMEM培养基将星形胶质细胞配成5×104 ml-1, 接种于24孔细胞培养板，单加LPS或同时加LPS和不同浓度α-MSH，分别于刺激后12、24、36、48、60、72 h收集细胞培养上清。
1.4 NO含量的测定 采用Griess试剂检测［6］。
1.5 前炎性细胞因子的检测 以胸腺细胞增殖测定IL-1；以B9杂交瘤细胞增殖测定IL-6；以细胞毒效应检测TNF-α，靶细胞为L929细胞；三种检测均采用MTT显色法。
1.6 半定量RT-PCR 大鼠MIF 5′端引物：CGGAATTCCATGCCTATGTTCATCGTGAAC, 3′端引物：GCCAAGGTGGAAGCGAACTCCTAGGAA,扩增片段为351 bp;β-actin 5′端引物：TGGAATCCTGTGGCATCCA-TGAAAC, 3′端引物：TAAAACGCAGCTCAGTAACAGT-CCG, 扩增片段为349 bp。用Trizol RNA快速抽提试剂提取星形胶质细胞总RNA。以2 μg细胞总RNA为模板进行反转录。反应条件：H2O 12 μl，5×RT buffer 4 μl，oligo dT15(500 μg/ml) 0.5 μl，dNTP(10 mmol/L) 1 μl，M-MuLV酶0.5 μl，37℃反应1 h。灭活反转录酶后，以2 μl cDNA为模板进行PCR，反应参数：94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环。PCR产物于2%琼脂糖凝胶上电泳观察结果。
1.7 统计学处理 采用student's t检验。
2 结果
2.1 α-MSH对LPS诱导星形胶质细胞产生NO的影响 星形胶质细胞经10 μg/ml LPS刺激12、24和36 h后，NO含量明显增加，而1 ng/ml LPS 和100 ng/ml LPS刺激后，NO含量与对照组比较相差不显著。在10 μg/ml LPS刺激的同时给予0.1 nmol/L或10 nmol/L α-MSH，对星形胶质细胞产生NO具有非常显著的抑制作用(图1)。
2.2 α-MSH对LPS诱导星形胶质细胞产生IL-1的影响 如图2所示，未经LPS刺激的星形胶质细胞IL-1分泌量较低，于培养36 h时有一个较低的分泌峰；LPS刺激后星形胶质细胞产生IL-1明显增加， 以24～36 h 时最明显；在LPS刺激的同时加入α-MSH 10 nmol/L能够显著抑制LPS诱导的IL-1分泌。
2.3 α-MSH对LPS诱导星形胶质细胞产生IL-6的影响 星形胶质细胞培养12 h 时自发分泌IL-6较多， 随后逐渐减少；LPS刺激后12～24 h出现明显增高的分泌峰，24 h后逐渐下降，但仍高于自发分泌；同时加入LPS和α-MSH 10 nmol/L作用12～24 h，对IL-6的分泌具有非常显著的抑制作用(图3)。
图1 α-MSH对LPS诱导星形胶质细胞产生NO的影响
Fig.1 Effect of α-MSH on the production of nitric oxide in astrocytes induced by LPS
Note:A.control；B.LPS；C.LPS+α-MSH(10 nmol/L)；D.LPS+α-MSH(0.1 nmol/L)，* P＜0.05 vs LPS group, * * P＜0.01 vs group
图2 α-MSH对LPS诱导星形胶质细胞产生IL-1的影响
Fig.2 Effect of α-MSH on the production of IL-1 in astrocytes induced by LPS
Note:* P＜0.01 vs LPS group
图3 α-MSH对LPS诱导星形胶质细胞产生IL-6影响
Fig.3 Effect of α-MSH on the production of IL-6 in astrocytes induced by LPS
Note:*P＜0.01 vs LPS group
图4 α-MSH对LPS诱导星形胶质细胞产生TNF-α影响
Fig.4 Effect of α-MSH on the production of TNF-α in astrocytes induced by LPS
Note:*P＜0.05 vs LPS group，* *P＜0.01 vs LPS group
图5 LPS刺激后星形胶质细胞MIF mRNA的表达
Fig.5 Expression of MIF mRNA in astrocytes after LPS stimulation
Note:M.marker;1.unstimulated;2,4,6,8,10.LPS(10 μl/ml);3,5,7,9,11.LPS(100 ng/ml);2,3.stimulated for 1 hour;4,5.stimulated for 2 hours;6,7.stimulated for 4 hours;8,9.stimulated for 8 hours;10,11.stimulated for 12 hours
6 α-MSH对LPS诱导星形胶质细胞表达MIF mRNA的影响
Fig.6 Expression of α-MSH on expression of MIF mRNA in astrocytes induced by LPS
Note:M.marker;1:unstimulated;2.LPS(10 μg/ml);3.LPS(10 μg/ml)+α-MSH(1 000 nmol/L);4.LPS(10 μg/ml)+α-MSH(10 nmol/L);5.LPS(10 μg/ml)+α-MSH(0.1 nmol/L);6.LPS(10 μg/ml)+α-MSH(0.001 nmol/L)
2.4 α-MSH对LPS诱导星形胶质细胞产生TNF-α的影响 从图4可以看出， LPS刺激后星形胶质细胞分泌TNF-α明显增加；在LPS刺激的同时加入α-MSH 10 nmol/L能显著抑制LPS诱导的TNF- α分泌。
2.5 α-MSH对LPS诱导星形胶质细胞表达MIF mRNA的影响 RT-PCR结果显示，未经LPS刺激的星形胶质细胞能表达较低水平的MIF mRNA； 10 μg/ml LPS作用1 h后,MIF mRNA表达水平较未刺激时降低， 4 h后MIF mRNA表达开始增高， 8 h后增高最为明显，而100 ng/ml LPS作用12 h后才出现MIF mRNA表达增高(图5)。在10 μg/ml LPS刺激的同时分别加入不同浓度的α-MSH(0.001 nmol/L、0.100 nmol/L、10.000 nmol/L、1 000.000 nmol/L)作用星形胶质细胞8 h 后，对LPS引起的MIF mRNA高表达均有抑制作用(图6)。
3 讨论
星形胶质细胞是脑内主要的神经胶质细胞，不仅有支持、营养神经元，参与物质转运和代谢等重要作用，而且能够产生多种细胞因子，如IL-1α/β、IL-6和TNF-α等前炎性细胞因子，受某些因素刺激后具有抗原提呈功能，可以对趋化因子发生反应，故被认为是脑内特化的免疫细胞。星形胶质细胞的这些功能在脑内炎症中起重要作用，并影响中枢神经系统的功能，进而影响对机体整体功能的调控。已知α-MSH对多种炎症反应包括脑内炎症有抑制作用，因此本研究以体外培养的大鼠脑星形胶质细胞为对象，观察了α-MSH对星形胶质细胞经LPS刺激后产生NO和前炎性细胞因子的影响，以期探讨α-MSH的抗炎机制。
NO是生物体内重要的信使分子和效应分子，在中枢神经系统中NO不仅是一种炎症介质，而且可调节中枢神经递质的释放和脑血流，影响突触传递、学习和记忆等。大量研究表明，IL-1、IL-6、TNF-α等前炎性细胞因子作为免疫系统和神经内分泌系统相互作用的信息分子在脑内病理过程中具有重要地位，可以影响中枢神经系统产生神经递质、垂体产生神经肽、胶质细胞产生神经生长因子，影响神经元的电活动，并能调节神经胶质细胞和神经元的生长分化及神经组织表达MHC分子。新近的研究表明， 在LPS的作用下，各重要脏器中MIF mRNA表达和蛋白质分泌显著增高［7］，MIF抗体对内毒素血症小鼠具有明显的保护作用［8］，证明MIF是全身炎症反应的重要介质。体外实验又发现，MIF能够拮抗糖皮质激素抑制单核细胞产生前炎性细胞因子的作用［9］，表明MIF参与炎症病理过程中神经内分泌免疫调节网络。我们的实验结果显示，α-MSH能够抑制LPS诱导星形胶质细胞产生NO、IL-1、IL-6、TNF-α和表达MIF mRNA， 提示α-MSH抑制脑内炎症反应与此有关，并可能通过抑制高浓度炎症介质所致的中枢神经系统功能改变，进而减少全身炎症反应时由于中枢神经系统功能改变而引起的机体整体功能紊乱，这或许是α-MSH对全身炎症反应具有抑制作用的机制之一。目前尚无报道证实星形胶质细胞表达α-MSH受体，α-MSH抑制星形胶质细胞产生炎症介质的作用是否通过与α-MSH受体结合实现，以及信号转导机制如何，尚待进一步探明，我们对此十分关注，并正在进行相关研究。
本项目受国家自然科学基金(No.39670280)和全军医药卫生科研基金(No. 98M073)资助
作者简介：吴秀菊，女，27岁，博士研究生；田野苹，女，47岁，教授，博士生导师，主要从事神经内分泌免疫调节的研究
参考文献
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9，Calandra T, Bernhagen J, Metz C N et al. MIF as a glucocorticoid-induced modulator of cytokine production. Nature, 1995;377:68
收稿2000-03-29
修回2000-07-21