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未成熟树突细胞诱导同种免疫低应答性的研究
中国免疫学杂志 2000年第11期第16卷 分子与细胞免疫学
作者：叶闻斐 何球藻
单位：上海医科大学免疫学研究室，上海200032
关键词: 树突细胞；同种低应答性；混合淋巴细胞反应
摘 要 目的：证实缺少辅助刺激分子的未成熟树突细胞(DC)在体外诱 导同种T细胞的低应答性。方法：应用骨髓微血管内皮细胞作为饲养细胞扩增同品系小鼠骨髓细胞 ，经不同浓度GM-CSF作用，在体外培养出不同发育阶段的DC。采用初次和再次单向混合淋 巴细胞培养方法观察Balb/c小鼠脾脏T细胞对同种未成熟DC或脾细胞的应答能力。结果：在初次MLR试验中，Balb/c T细胞对C57BL/6小鼠未成熟DC刺激只 呈现出微弱的增殖反应，SI=2.84±0.60，明显低于对相应品系鼠成熟DC或脾细胞的增殖 反应(SI分别为15.72±6.49，6.57±2.85)；在再次MLR系统中，经未成熟DC预处理的Ba lb /c T细胞对C57BL/6来源的脾脏细胞只发生低应答反应(SI=1.29±0.19)，而对无关品系AK R的脾脏细胞仍显示较高的增殖能力(SI=10.64±1.89)。结论：缺乏辅助刺激分子的未成熟DC在体外MLR系统中诱导出同种Balb/ c小鼠T细胞免疫低应答性。
中国图书分类号 R392.4
Experimental study on induction of allo-hypo-immuno- responsiveness by immature dendritic cells
YE Wen-Fei,HE Qiu-Zao.
(Department of Immunology,Shanghai University of Medicine ，Shanghai 200032)
Abstract Objective:To testify the induction of allo -hypo-immuno-responsiveness by immature dendritic cells(DC)with deficiency of costi mulators.Methods:Bone marrow microvessel endothelial cell s (BMEC)from C57BL/6 mice were used as feed cells.Bone marrow cells from the sam e strain were expanded in this culture without differentiation.Those expanded bo n e marrow cells would differentiate to dendritic cells at different stages accord ing to the concentrations of GM-CSF.The primary and secondary mixed lymphocyte reaction(MLR)assay was used to be a model in vitro to analyze response of Balb/c T cells to allogenic immature DC or splenocytes.Results:Balb/c T cells proliferated weakly to C57BL/6 imma ture DC in primary MLR,SI=2.84±0.60,which was extremely lower than to C57BL/6 mature DC or splenocyte(SI=15.72±6.49,6.57±2.85 respectively);in secon dary MLR,prime d by immature DC,Balb/c T cells showed low responsiveness to C57BL/6 splenocyte( SI=1.29±0.19),while a strong proliferation to AKR could be detected(SI=10.64 ±1.89).Conclusion:Immature DCs with deficiency of costi m ulators could induce an allo-hypo-immuno-responsiveness of Balb/c mice in MLR in vitro.
Key words Dendritic cell Allo-hypo-immuno -responsiveness Mixed lymphocyte reaction
树突细胞(dendritic cell,DC)是功能很强的专职抗原递呈细胞(antigen presenting cell, APC)［1］。成熟DC表面表达丰富的MHC分子和辅助刺激分子，能有效地递呈抗原并激 活T细胞发生免疫应答。而在骨髓细胞分化到成熟DC过程中的某一阶段，细胞表面呈现高 表达的MHC分子，而只低表达辅助刺激分子。这种未成熟DC缺乏启动T细胞应答的功能［ 2］。已知T细胞的活化需要接受两个以上的信号刺激，单独通过TCR对MHC复合体/抗原肽 的识别通常不能引起T细胞充分活化，反而诱导出免疫耐受或低应答状态［3］。利用 未成熟DC缺乏辅助刺激分子这一特点，有可能在体外诱导出同种低应答反 应，并可能作为同 种移植耐受的耐受原，在延长移植物存活时间中起作用。本文利用骨髓内皮细胞作为 饲养细胞在体外扩增骨髓细胞后，经GM-CSF 诱导培养得到大量 未成熟DC，在体外初次和再次MLR系统中诱导同种异品系T细胞产生免疫应答反应。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 用干粉按常规分别配制成10%FCS-PRMI1640完全培养液 ， 20%FCS-DMEM完全培养液和20%FCS-IMDM完全培养液；抗CD86-FITC和抗CD80-FITC(Pharm ingen公司产品)。抗H-2Kd-PE和抗H-2-I-Ab-FITC(beckon-dickson公司产品)。 DEC205单克隆抗体，取自DEC205杂交瘤细胞培养上清液。抗大鼠Ig-FITC(Pharmingen公司 产品)，GM-CSF(R&D公司产品)。
1.2 细胞株 BMEC小鼠骨髓微血管内皮细胞，来源于C57BL/6(H-2d)， 由上海市胸科医院，胸部肿瘤研究所董强刚博士惠赠。DEC205杂交瘤细胞由美国University of Pittsburgh,Prof Lina Lu惠赠。
1.3 动物 C57BL/6(H-2b)，Balb/c(H-2d)，AKR(H-2k)小鼠， 均为6～8周龄，18～20 g，清洁级，均购自中国科学院上海实验动物中心。
1.4 树突细胞的培养
1.4.1 骨髓细胞的扩增 按文献［4］报道方法。
1.4.2 DC的培养 取已扩增的骨髓细胞，重悬于10%FCS-1640完全培养 液中，2×106细胞/孔置于24孔板中，加细胞因子GM-CSF 4 ng/ml，37℃，5%CO2，培 养2 d。吸去75%培养液和非粘附细胞，重新补足培养液及细胞因子GM-CSF 4 ng/ml，37℃ ， 5%CO2，继续培养3 d，收集低粘附细胞，即为未成熟DC。同样条件下增加GM-CSF含量(10 ng/ml)并在交换培养液时添加TNF-α 200 U/ml，37℃，5%CO2，继续培养3 d。收集悬 浮细胞，可收集到成熟的DC［5］。
1.5 树突细胞的鉴定 光镜观察形态变化和FACS检测其表面标记。
1.6 初次MLR 无菌条件下置备BALB/c鼠脾脏细胞悬液，经尼龙毛柱［6］纯化得到的T淋巴细胞作为应答细胞。经Thy-1抗体用CDC法检测T细胞纯度为89 % 。刺激细胞分别为C57BL/6不成熟DC、成熟的DC和C57BL/6的脾脏细胞以Balb/c的脾脏细胞为 阴 性对照，均经丝裂霉素灭活。在表1中分别以imDCm,mDCm,C57m,Balb/cm代表刺激细胞 与应答细胞的比例为1∶1，1∶10，1∶100加入9 6孔圆底培养板各孔。应答细胞为2×105/孔，刺激细胞分别为2×105/孔，2×104/孔 ，2×103/孔，总体积为200 μl/孔，均设3复孔置37℃5%CO2混合培养3 d或5 d，终止 反应前18 h加入3 H-TdR 0.5 μCi/孔，培养结束时用多头细胞收集仪将细胞收集于 纤 维滤纸上，β液闪仪测定cpm值，反应强度以SI表示。刺激指数(SI)按公式SI=实验组cpm值/(灭活刺激细胞的cpm+应答细胞的cpm)计算。
1.7 再次MLR［7］ 收集经丝裂霉素灭活的未成熟的C57BL/6 DC与 新鲜分离的Balb/c T细胞，分别调整细胞数为2×107按1∶1后混合于50 ml培养瓶中直立 培 养，总液量为15 ml，37℃，5%CO2培养3 d后加入高磷酸缓冲液(HPBS)3 ml经低速离心(50 0 r/min×15 min)去除沉淀死细胞，取上层细胞悬液即为预处理的T细胞，洗涤3次后，调 整细胞 数 为2×106 ml-1，作为应答细胞，按每孔2×105/100 μl加入96孔培养板。分 别取不同品系 鼠(C57BL/6，AKR)的脾细胞经丝裂霉素灭活后作为刺激细胞，按应答细胞与刺激细胞比例为 1∶1，1∶10，1∶100作MLR，总液量为200 μl/孔。每一组合设3个复孔，置37℃，5%CO2 培养5 d，终止培养前18 h加入3 H-TdR(0.5 μCi)，多头细胞收集仪收集细胞，测cp m值反应强度用SI表示。
2 结果
2.1 培养的树突细胞的得率和特性 以骨髓内皮细胞为饲养细胞，配合不 同浓度GM-CSF或添加TNF-α在体外可培养出不同发育阶段的DC。在单独使用GM-CSF的5 d 培养结束时，可获得未成熟DC约1.7×108/鼠，经相对特异的DEC-2 05分子测定其纯度为71.18%，表面的MHC I类和II类分子分别为99.44%和61.94%；B7-1 和B7-2的表达分别为48.72%和11.86%。添加TNF-α的5 d培养结束时，可获得成熟的DC 约2.5×108/鼠，纯度为96.26%，表面的MHC I类和II类分子分别为99.22%和96.94%； B7-1和B7-2的表达分别为50.78%和91.18%。在形态上，未成熟的DC毛刺较短，分支较少 。成熟DC毛刺较长，突起尖锐，分支多，在高倍镜下呈现树叉样的特征性结构。
2.2 不同发育阶段DC在初次MLR中诱导的同种免疫应答反应 实验结果显 示，成熟DC在初次同种MLR中诱导出很强的增殖应答反应，且在3 d内即达高峰，随后下降， 而 未成熟DC无论在3 d或5 d的初次同种MLR中都显示出很微弱的刺激作用。实验数据归纳于表1 ，2。
2.3 未成熟DC预处理的Babl/c T细胞在再次MLR系统中对同种细胞 的低应答反应 经初次MLR预先致敏的Balb/c T细胞与被致敏同一品系鼠的脾细胞作再次MLR时，Balb/c T细 胞仍呈低应答性，但对无关品系小鼠脾细胞刺激却表现出强烈的应答(见表3)。
表1 未成熟DC诱导初次同种MLR(3 d培养)结果(n=4)
Tab.1 3-day primary MLR induced by immature DCS (n=4)
| Stimulator：effectorStimulator | Balb/c T cell | ||
| 1∶1 | 1∶10 | 1∶100 | |
| mDCm | 15.72±6.491) | 5.40±3.15 | 2.33±1.86 |
| imDCm | 2.84±0.60 | 2.65±0.64 | 1.59±0.58 |
| C57m | 6.57±2.85 | 4.12±1.12 | 2.98±1.69 |
| Balb/cm | 1.99±0.71 | 1.97±1.08 | 1.72±1.10 |
note:SI
Tab.2 5-day primary MLR induced by immature DCs (n=4)
| Stimulator：effectorStimulator | Balb/c T cell | ||
| 1∶1 | 1∶10 | 1∶100 | |
| mDCm | 2.31±0.841) | 2.57±1.85 | 1.36±0.65 |
| imDCm | 1.70±0.41 | 1.39±0.60 | 0.96±0.35 |
| C57m | 7.85±3.31 | 4.77±2.12 | 1.43±1.01 |
| Balb/cm | 1.28±0.67 | 0.71±0.42 | 0.76±0.24 |
note:SI
Tab.3 Response of primed T cell in secondary MLR(n=3)
| Stimulator：effectorStimulator | 1∶1 | 1∶10 | 1∶100 |
| C57m | 1.29±0.19* | 1.15±0.26 | 1.04±0.09 |
| AKRm | 10.64±1.89 | 6.57±1.96 | 2.70±1.62 |
note:1)SI，
3 讨论
我们曾报道用骨髓内皮细胞作为饲养细胞在体外扩增骨髓细胞，在GM-CSF和TNF-α诱导下 可分化为成熟DC［8］。本文通过调整GM-CSF浓度可收集到足够数量和高纯度的未成 熟DC用于实验研究。实验结果显示，未成熟DC与成熟DC的最大差别是前者细胞表达很低的CD 86分子。这种缺乏辅助刺激分子的未成熟DC无论在3 d或5 d初次单向MLR实验系统中只能诱 发同种异品系小鼠T细胞产生免疫低应答反应，其反应程度不仅明显低于成熟DC诱导的T淋巴 细胞增殖反应，而且也低于常规脾脏细胞诱导的T淋巴细胞增殖反应，略高于同系小鼠的阴 性对照组(表1，2)。特别在3 d MLR系统中更为突出，因为成熟DC具有很强刺激同种T细胞的 功能，在3 d培养时反应强度已达高峰，随后则逐渐下降，这可能与部分活化T细胞发生凋亡 有关。 经体外事先用C57BL/6未成熟DC致敏过的Balb/c T细胞作再次MLR的实验结果表明，这种 致敏 的Balb/c T淋巴细胞，在再次接受C57脾脏细胞刺激时应答也明显低下，但这种经预处理的T 细胞并未丧失同种免疫应答的能力，因为用无关品系的AKR脾细胞刺激时仍表现很强的增殖 反应。这可能是Balb/c T细胞在初次MLR与C57BL/6未成熟DC相互作用后处于一种无应答或耐 受状态，当再次用初次致敏相同品系的脾细胞刺激时则不发生应答而表现为增殖反应低下。 但却对无关品系小鼠脾细胞的刺激表现强应答，这也提示未成熟DC所诱导的同种免疫低应答 性具有特异性。
本文实验结果为T细胞活化需要接受多个刺激信号的理论提供了实验依据，这可能为诱导同 种移植免疫耐受开拓新的途径。
受国家自然科学基金重点项目资助(编号39830340)
作者简介：叶闻斐，硕士研究生，助教，主要从事移植免疫学研究；何球藻，教授，长期从事肿瘤免疫、移植免疫学研究
参考文献
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［收稿2000-04-28］