人工合成HLA肽对淋巴细胞增殖反应的影响

人工合成HLA肽对淋巴细胞增殖反应的影响

免疫学杂志 1999年第1期第0卷 基础免疫学

作者：汪泽厚¹　朱锡华²　曾　毅¹　刘素英¹

单位：汪泽厚　曾　毅　刘素英　　第三军大学新桥医院泌尿外科重庆4000037； 朱锡华　第三军大学免疫学教研室，中国人民解放军免疫学研究所重庆400038

关键词：HLA肽　淋巴细胞　等位基因

　　　摘　要　人工固相合成两种HLA肽（P1：HLA-B0701．75-84；P2：HLA-B2702．75-84），用MTT法观察其在体外对具有不同HLA表型淋巴细胞增殖反应的影响及其等位基因特异性。结果显示：P1和P2均可显著抑制淋巴细胞的增殖反应；且这种抑制作用无等位基因特异性。

　　中图号　R392.4

EFFECT OF SYNTHETIC PEPTIDES DERIVED FROM HLA ON LYMPHOCYTE TRANSFORMATION AND MLR

Wang Zehou， Zhu Xihua， Zeng Yi，Liu Suying

　　（Urology Department， Xinqiao Hospital， Third Military Medical University， Chongqing， 400037）

　　Abstract Two peptides derived from HLA， HLA-B7．0701．75-84 and HLA-B7．2702．75-84， were synthesized． The effect of the peptides on lymphocyte transformation and MLR determined using MTT method was observed． The allele specificity of the peptides on these was analysed． The result shown that the synthetic peptides can inhibit the proliferation of the lymphocyte with different HLA phenotype as well as there is no allele specificity on this inhibition．

　　Key words Peptide derived from HLA， Lymphocyte， MLR

　　器官移植已成为治疗多种器官功能衰竭的有效手段，但排斥反应是影响其成功率的主要障碍。诱导受者产生抗原特异性免疫耐受，避免因终生服用现有免疫抑制剂引起的各种毒副作用，提高器官移植的成功率和受者的生活质量是人们不懈追求的目标。近年国外研究报道，人工合成HLA肽（HLA-derived　peptides）在体外能够抑制淋巴细胞的增殖反应，诱导受者产生特异性免疫耐受，延长移植物存活时间^［1，2］。本实验人工合成两种HLA肽，观察其在体外对人淋巴细胞增殖反应的影响及等位基因特异性。

　　1　材料与方法

　　1.1　主要试剂　RPMI1640培养基，胎牛血清（GIBCO），ConA（Sigma），MTT（Fluka），丝裂霉素C（日本），淋巴细胞分离液（上海试剂二厂），HLA-A，B单克隆抗体分型板（美国莱姆德公司，产品代号：ASN72D）。

　　1.2　人工合成HLA肽　合成HLA肽的序列：P1序列为HLA-B0702．75-84；P2序列为HLA-B2701·75-84，用自动固相肽合成仪（ABI431A），按标准Fmoc方案合成，反相高压液相（preparative　reverse　phase　HPLC）纯化，纯度98％，低温冷冻干燥后分装备用。

　　1.3　方法

　　1.3.1　淋巴细胞分离：3名健康正常人（编号分别为A、B、C）外周血，肝素抗凝，Ficoll-Hypaque方法分离淋巴细胞。

　　1.3.2　HLA-A，B分型：参照莱姆德公司说明书及文献方法^［3］，用微量淋巴细胞毒试验方法进行HLA-A，B分型，确定HLA-A，B表型。

　　1.3.3　淋巴细胞转化试验：参照Mossmann及文献方法改进^［4，5］，分离的淋巴细胞悬于含20％胎牛血清RPMI1640培养液，调整细胞浓度后加于96孔细胞培板，每孔含200μl淋巴细胞悬液，淋巴细胞浓度为2×10⁶／ml，设3个复孔，内含最适ConA浓度5．0μg／ml及不同浓度合成HLA肽（同时加入），于5％CO₂，37°C培养箱中培养72h，离心后每孔吸去上清100μl，加入0．5μg／ml MTT的RPMI1640 100μl，继续培养4h，离心后吸弃全部上清，每孔加入100μl二甲亚枫，置37°C 10min，用DG3022型酶标仪测OD值，波长570nm，计算抑制率（％）＝（1－实验组OD₅₇₀值／空白组OD₅₇₀值）×100。

　　1.3.4　单向混合淋巴细胞反应（MLR）：丝裂霉素C处理的淋巴细胞作为刺激细胞，充分洗涤后与应答细胞按1∶1比例混合，两者浓度均为3．3×10／ml，混合后加入96孔培养板，每孔200μl，合成HLA肽浓度为100μg／ml，设3个复孔，37°C，5％CO₂培养。MTT法测每孔OD₅₇₀值。

　　2　结果

　　2.1　合成HLA肽对淋巴细胞转化的影响　从图1可见两种合成HLA肽均对由ConA引起的淋巴细

　　胞转化具有抑制作用，在100μg／ml浓度时，抑制达最大值，浓度增加至150μg／ml，未见进一步影响淋巴细胞的转化能力。P1和P2对淋巴细胞转化能力的影响，两者之间无显著差异（P＞0．05），见表1。

图1　合成肽浓度与淋巴细胞转化率的关系

　　Fig1Relationship　between　the　peptid　concentration　and　the　lymphocyte　transformation

表1　合成HLA肽对淋巴细胞转化的影响及其等位基因特异性

　　Tab　1　Effect　of　synthetic　peptides　（P）　derived　from　HLA　on　lymphocyte　transformation　and　allelle　specificity

Lymphocyte 　　（HLA-A，B 　　phenotype）	P　（μg／ml）	OD570（
		0	50	100▲	150
A	P1	0．561±0．012	0．511±0．008	0．463±0．005	0．465±0．012
（A2，A9，B15，B45）	P2	0．520±0．005	0．496±0．021	0．473±0．008	0．466±0．005
B	P1	0．520±0．014	0．488±0．011	0．466±0．012	0．464±0．008
（A2，／，B40，B57）	P2	0．516±0．005	0．510±0．005	0．467±0．009	0．463±0．009
C	P1	0．516±0．012	0．496±0．016	0．467±0．012	0．468±0．009
（A2，A24，B15，B46）	P2	0．520±0．005	0．493±0．012	0．466±0．008	0．467±0．011

　　^▲P＜0．05　compared　with　control

　　2.2　合成HLA肽对MLR的影响　用不同HLA-A，B表型健康人淋巴细胞作为MLR反应体系中的应答细胞，以丝裂霉C处理的不同HLA-A，B表型淋巴细胞作为刺激细胞，观察合成HLA肽对不同HLA-A，B表型应答细胞与不同表型刺激细胞反应的影响，发现两种肽均能抑制不同表型应答细胞对不同表型刺激细胞的反应能力（见表2），这种抑制作用在两种肽之间无显著差异（P＞0．05）。

　表2　合成HLA肽对MLR的影响及其等位基因特异性

　　Tab2Effects　on　MLR　and　their　allelle　specificity　of　synthetic　peptides　（P）　derived　from　HLA

Responder 　　（HLA-A，B　phenotype）	Stimulator 　　（HLA-A，B　phenotype）	P 　　（μg／ml）	OD570（		Inhibitory 　　Rate（％）△
			0	100▲
A	B	P1	0．710±0．022	0．420±0．016	40.8
（A2，A9，B15，Bw6）	（A2，／，B57，B40）	P2	0．740±0．016	0．422±0．005	42．8
B	C	P1	0．726±0．016	0．427±0．026	41．2
（A2，／，B57，B40）	（A2，A24，B46，Bw6）	P2	0．723±0．012	0．417±0．017	42．3
C	A	P1	0．713±0．026	0．430±0．022	38．8
（A2，A24，B46，Bw4）	（A2，A9，B15，Bw6）	P2	0．716±0．005	0．423±0．019	40．9

　　^▲P＜0．05　compared　with　control；^△P＞0．05　compared　between　P1　and　P2

　　2.3　合成HLA肽对淋巴细胞转化能力影响的等位基因特异性（allele　specificity）　表1结果显示，人工合成的两种HLA肽对ConA诱导淋巴细胞转化能力的影响与淋巴细胞表型无关，在MLR体系中亦观察到类似结果（表2），表示本实验所用人工合成的两种HLA肽：HLA-B2702．75-84和HLA-B2701．75-84，在体外对淋巴细胞增殖反应的影响没有等位基因特异性。

　　3　讨论

　　HLA是一具有高度多态性的复等位基因系统，具有细胞间相互识别和诱导免疫反应等许多重要功能，是导致移植排斥反应的主要抗原。很早人们就注意到术前多次输血，可减轻同种移植排斥反应的强度，延长移植物存活时间，但当除去血液中可溶性HLA后，则这种作用消失，表明可溶性HLA是导致同种移植物存活时间延长的主要成份^［2］。之后研究者合成许多相当于HLA不同区域序列的多肽，其中有些在体外可抑制淋巴细胞的增殖反应能力，有些则没有^［1，2］。

　　最早人们考虑到HLA-A2在人群中表型频率较高，便用序列比较和单克隆抗体对HLA-A2某一区域的反应性等方法，确定HLA-A2氨基酸的主要功能区域，研究者人工合成相当于这些区域氨基酸序列的多肽，诱导产生淋巴细胞无反应性（anergy）或免疫耐受。但因这种作用具有等位基因特异性^［2］，而无临床应用前景，于是人们又将注意力转向HLA其它区域。Clayberger等^［7］合成相当于HLA-I类分子与TCR和与CD₈或CD₄结合区域氨基酸（222至235）序列的多肽，能够抑制淋巴细胞的增殖反应。许多研究者相继合成相当于HLA肽结合沟槽相对保守区域的氨基酸序列的多肽，结果发现其中有些具有抑制淋巴细胞增殖反应的能力，延长同种移植物存活时间。之后经大量筛选，发现相当于HLA-B7（属B7超基序家族）肽结合槽相对保守区氨基酸序列的多肽，诱导淋巴细胞无反应性作用最强，且无等位基因特异性，动物实验结果显示能够诱导受者产生供者特异性免疫耐受^{［1，2，6～8］}。目前国内尚未见到有关人工合成HLA肽诱导淋巴细胞无反性和免疫耐受的报道，考虑到中国人和欧美人HLA基因表型的差异,我们合成两种相当于HLA-B7肽结合槽保守序列区的多肽，即HLA-B2702.75-84和HLA-B0701.75-84，属于B7超基序家族。在体外观察对不同HLA表型的健康人外周血淋巴细胞增殖能力的影响，发现合成的这两种HLA肽在体外具有抑制淋巴细胞增殖反应的能力。这种抑制作用包括由非特异性的植物凝集素ConA诱导和在MLR体系中由特异性抗原诱导的增殖反应，没有等位基特异性，即这种抑制作用与淋巴细胞的HLA表型无关，这与文献报道结果一致^［1，2］。从而还印证了相当于HLA-α1保守区氨基酸序列的多肽，对东方人淋巴细胞增殖能力的影响，与对欧美人一样亦不受HLA表型影响。

　　第一作者：男，46岁，博士，副主任医师

　　参考文献

　　［1］　汪泽厚，朱锡华.合成MHC肽诱导移植免疫耐受的研究现状.国外医学免疫学分册，1998，4：214

　　［2］　Sayegh　MH， Krensky AM．Novel immunotherapeutic strategies using MHC derived peptides． Kid Int， 1996，49（suppl．53）：S－13

　　［3］ 赵酮茂.HLA分型原理和应用.上海科学技术出版社，1984．275

　　［4］ Mosmann T．Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival： Application to proliferation and cytotoxicity assays． J Immun Meth，1983，65：55

　　［5］ 周道洪，沈元珊，赵曼瑞.测定淋巴细胞转化和鼠白细胞介素-2活性的新方法——MTT比色法.中国免疫学杂志，1986，2：39

　　［6］ Clayberger C，Lyu SC， Poultty P， et al． Peptides corresponding to T cell receptor-HLA contact regions inhibit class I restricted immune responses． Transplant Proc， 1993，25：477

　　［7］ Clayberger C，Lyu SC， Dekruyff R， et al． Peptides corresponding to the CD8 and CD4 binding domains of HLA molecules block T lymphocyte immune responses in vitro． J Immunol， 1994， 53：946

　　［8］Nobner E，Goldberg JE， Naftzger C， et al． HLA-derived peptides which inhibit T cell function bind to members of the heat-shoch 70 family． J Exp Med， 1996，183：339

（1998-10-13收稿；1998-11-17修回）