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抗CD95单克隆抗体诱导的活化T细胞凋亡时转录因子nur77的表达
免疫学杂志 1999年第3期第15卷 基础免疫学
作者：成 军 斯崇文 王勤环 刘 妍 洪卫国 钟彦伟 杨继珍
单位：：成 军 刘 妍 洪卫国 钟彦伟 杨继珍 解放军302医院传染病研究所基因治疗研究中心 北京 100039；斯崇文 王勤环 北京医科大学第一医院传染病教研室 北京 100034
关键词：CD95 细胞凋亡 T细胞 转录因子 单克隆抗体
摘 要 以抗CD95的特异性单克隆抗体（CH-11）诱导人T细胞Jurkat细胞系发生凋亡，Jurkat细胞在发生凋亡过程中出现典型的DNA梯形片段化，以荧光染料（PI）标记的流式细胞学技术对于发生凋亡的细胞进行定量测定，证实发生凋亡的细胞百分比在各个时间点上为6．1％～43．5％之间。以电泳泳动迁移率（EMSA）对于发生凋亡的细胞核中转录因子nur77的表达进行了研究，发现以抗CD95单克隆抗体诱导的活化T细胞发生凋亡时，nur77转录因子表达水平有显著提高。研究结果对了解细胞凋亡时的信号转导与分子生物学机制具有重要意义。
中图号 R335
TRANSCRIPTION FACTOR NUR77 EXPRESSION IN APOPTO-TIC T CELLS INDUCED BY ANTI-CD95 MONOCLONAL ANTIBODY
Cheng Jun，Si Chongweng，Wang Qinhuan，Liu Yan，Hong Weiguo，Zhong Yanwei，Yang Jizhen
（Gene Therapy Research Center，The 302 Hospital of PLA，Beijing 100039）
Abstract The apoptotic Jurkat cells induced by anti-CD95 monoclonal antibody CH-11 were confirmed by DNA fragmentation and flow cytometry assay with PI staining．6．1％ to 43．5％ of the cells were dying via apoptosis after induction with 10μg／L of anti-CD95 monoclonal antibody CH-11 for 0～24 hours．The transcription factor expression in apoptotic cells was studied by the electrophoretic mobility shift assay（EMSA），indicating that nur77 expression maybe involved in apoptosis regulating process of activated T cells induced by anti-CD95 antibody．
Key words CD95，Apoptosis，T cells，Transcription factor，Monoclonal antibody
CD95，又称为Fas／APO-1，是许多正常和肿瘤细胞膜上表达的一种约45KDa的跨膜糖蛋白，可以介导Fas配体（FasL）或抗CD95抗体所诱发的细胞凋亡信号向胞浆和胞核中进行转导［1］。由CD95跨膜信号经过在胞浆中的转导，最终到达胞核中，对特异性转录因子的活性与表达进行调节，以启动与细胞凋亡相关基因的转录。这是所有信号转导通路的最终公共途径，也是细胞凋亡作为一种细胞主动性死亡最为显著的特征及调节机制［2］。本文以抗CD95的抗体诱导T细胞系的细胞凋亡，研究了此种凋亡过程中转录因子nur77的表达。
1 材料与方法
1.1 细胞系与抗体 Jurkat细胞系购自美国标准培养物中心（ATCC），以含有10％的胎牛血清的RPMI 1640培养基培养。抗CD95单克隆抗体CH-11购自美国Calibiochem公司。
1.2 细胞凋亡的诱导与测定 细胞培养的密度为1×108／L，以台盼蓝排除法证实死亡细胞所占的比例小于2％。以10μg／L的抗CD95的抗体进行诱导，在不同的时间点上诱导的细胞分为3份，一份用于DNA片段化的测定［3］；一份以荧光染料（PI，propi-dium iodide）染色，进行流式细胞学分析［4］，对发生细胞凋亡的细胞进行定量测定；第3份细胞作为提取细胞核蛋白的材料。
1.3 电泳泳动迁移率（EMSA）检测转录因子nur77的表达 以常规方法［5］从诱导凋亡的Jurkat细胞中提取核蛋白，以T4多核苷酸激酶催化法对于转录因子nur77结合的特异性核苷酸片段进行（r-32P-dATP）末端标记，所使用的核苷酸片段的基因序列为5-TCGAGTTTTAAAGGTCATGCTCAATTTG-3。核蛋白与标记的核苷酸片段在冰浴条件下结合60min，以100g／L的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行分离，并进行放射自显影分析。由于有nur77转录因子蛋白与标记探针结合，以形成较大分子量的复合物，便于与未结合核蛋白的自由核苷酸片段的区别。为证实转录因子nur77与上述核苷酸片段之间结合的特异性，还以10、50和100倍浓度的未经标记的核苷酸片段进行竞争性结合抑制实验。
2 结果
2.1 细胞凋亡及其DNA的片段化的检测 以抗CD95分子的特异性抗体对于活化的Jurkat细胞进行诱导0、1、3、6、9、12和24h，以流式细胞技术检测，凋亡的细胞分别为4.3％、3.7％、6.1％、8.7％、15.3％、16.6％和43.5％，并可见到典型的DNA梯形片段化。如图1所示。
图 1抗CD95抗体（10μg／L）诱导Jurkat细胞不同时间点上DNA梯形片段化的琼脂糖凝胶电泳分析
Fig 1DNA ladder of Jurkat cells induced by 10μg／L anti-CD95 antibody with agarose gel electrophoresis
Lane 1 is a 100 bp DNA marker，and lanes 2，3，4，5，6，7，8 are the results after induction for 0，1，3，6，9，12 and 24 hours，respectively．
2.2 转录因子nur77在T细胞凋亡中的表达 以电泳泳动迁移率法（EMSA）对于活化T细胞受到抗CD95抗体诱导发生细胞凋亡时细胞核中转录因子nur77的转录表达进行研究。发现以抗CD95抗体诱导0h，即出现nur77转录因子进行特异性结合的核苷酸电泳迟滞放射自显影条带，这是由于在加入抗CD95抗体以后，细胞的收集过程需要离心大约5min，可见以抗CD95抗体诱导Jurkat细胞以后5min之内便有nur77转录因子蛋白的表达。在以抗CD95抗体诱导6和9h，以及24h也有一定的nur77转录因子蛋白的表达，如图2所示。
图 2Jurkat 细胞凋亡时细胞核转录因子nur77的表达
Fig 2Transcription factor nur77 expression in the apoptotic Jurkat cells induced by anti-CD95 antibody
Lane 1 is untreated Jurkat cells，and lane 2，3，4，5，6，7，8 are the cells induced for 0，1，3，6，9，12 and 24hours，respectively．
为了证实图2中所检测到的放射自显影条带为nur77转录因子核苷酸片段结合特异性的蛋白条带，又进行了竞争性结合抑制实验。以10，50和100倍浓度的未标记的相同核苷酸序列的探针，与同位素标记的探针进行竞争性结合抑制，这种条带即消失。证实图2所见的放射性自显影条带，为转录因子nur77与特异性核苷酸序列之间进行特异性结合的结果。竞争性结合抑制实验的结果如图3所示。
图 3转录因子nur77特异性未标记探针竞争性结合抑制
Fig 3Competitive inhibition with nur77-specific，unlabeled probe
1：induced with CH-11 for 5 min；2：Non-induced；3：Labeled，but non-specific probe competition；4：Unlabled，non-specific probe competition；5：Unlabled∶labeled＝10∶1，specific probe；6：Unlabled∶labeled＝50∶1，specific probe；7：Unlabled∶labeled＝100∶1，specific probe
3 讨论
激活的T淋巴细胞的凋亡可以有很多的信号转导通路，至少包括CD95与其配体（FasL）［6］，T细胞受体（TCR）与CD3分子结合形成的复合体［7］，糖皮质激素及其受体［8］，肿瘤坏死因子与其受体（TNFR）［9］，钙离子通道剂［10］以及放射线诱导［11］等。关于CD95信号转导通路的研究，发现白细胞介素-1转换酶（ICE）［12］，酸性鞘髓磷酯酶的激活与酰基鞘氨醇［13］、颗粒酶［14］等的激活之间有着十分密切的关系。T细胞的凋亡，作为1种类型的主动性死亡，其特点是涉及到新基因的激活与表达。即胞外的刺激信号通过跨膜受体蛋白，再通过细胞浆，最终到达细胞核，通过转录因子蛋白的表达，启动新基因的转录。这种新基因的转录产物到达胞浆以后，翻译成具有生物学活性的蛋白质，对于其凋亡过程产生影响［1］。因此，细胞在受到胞外信号的刺激以后，对于胞核中的转录因子表达的调节，是了解细胞凋亡分子生物学机制与信号转导的1个关键环节。
Nur77是细胞核内1种孤生类固醇受体（orphan steroid receptor）［15］。T细胞通过TCR通路诱导细胞凋亡过程中，可以快速诱导nur77的表达，以抗CD3抗体诱导的胸腺细胞发生凋亡时也可见到nur77的表达［2］。不仅如此，在小鼠成纤维细胞系NIH3T3受到有丝分裂原的刺激，神经元细胞系PC12受到有丝分裂原或分化信号的诱导以后，也能见到这种属于类固醇受体超家族，配体依赖性的转录因子nur77的表达［16，17］。因此，nur77的表达对于细胞凋亡的多种信号转导通路，对于不同来源的细胞，都具有普遍的意义。从本文以抗CD95抗体对于活化的T细胞的细胞凋亡的研究结果来看，由CD95分子跨膜信号转导通路，也与这种核转录因子的表达密切相关。与TCR／CD3信号，有丝分裂原以及分化信号所诱导的nur77表达过程类似；nur77的表达在T细胞受到抗CD95抗体诱导后的5min之内即出现明显的表达活性升高。这种诱导应答的速度非常快。结合对T细胞凋亡过程中DNA片段化及流式细胞学研究结果来看，只有在抗CD95抗体诱导3h之后，才会出现DNA的片段化以及凋亡细胞的出现。由此可推断CD95分子所介导的信号转导，至少是部分通过对nur77转录因子的表达来调节新基因的转录与细胞凋亡的过程。有关nur77的受体及其下游基因启动子序列的结合类型，目前不很清楚，但可以肯定，关于nur77转录因子的研究将有助于CD95分子介导的细胞凋亡信号转导通路的研究和了解。
第一作者：男，36岁，博士，副主任医师
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（1998-04-22收稿；1999-02-26修回）