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复制缺陷型鼠IL-3重组腺病毒的构建和鉴定
免疫学杂志 1999年第4期第15卷 基础免疫学
作者：刘 林 罗成基 袁良平 粟永平
单位：刘 林（ 第三军医大学新桥医院血液科 重庆 400037）；罗成基 袁良平 粟永平（第三军医大学复合伤研究所）
关键词：白细胞介素3 腺病毒载体 基因治疗
摘 要 构建以CMV启动子控制鼠IL-3基因表达的复制缺陷型腺病毒（AdCMVIL-3）。将含全部编码序列的鼠IL-3cDNA克隆于腺病毒穿梭质粒pMH4的CMV启动子下游，再与含腺病毒基因组的质粒pBHG10共转染293细胞，经细胞内同源重组后产生7个病毒空斑，取其中4个空斑扩增后经双引物PCR检测，结果均含有IL-3及腺病毒特有片段，表明成功地构建了携带鼠IL-3基因的复制缺陷型重组腺病毒。
中图号 Q782
CONSTRUCTION AND IDENTIFICATION OF REPLICATION-
DEFICIENT MOUSE INTERLEUKIN-3
RECOMBINANT ADENO-VIRUSES
Liu Lin
（Department of Hematology，Xinqiao Hospital，The Third Military Medical University，Chongqing 400037）
Luo Chengji，Yuan Liangping，Su Yongping
（Research Institute of Combined Injury，Faculty of Preventive Medicine，The Third Military Medical University，Chongqing 400038）
Abstract The full-length mouse IL-3 encoding cDNA was cloned at the downstream of CMV promoter of the adenoviral shuttle plasmid pMH4，and the resultant pMH4-IL-3 was cotransfected into 293 cells together with the plasmid pBHG10 carried the adenoviral genome．Among 7 plaques generated by homologous recombination，4 plaques were picked out and identified by PCR co-amplification．The result showed that every plaque had both the fragment of IL-3 and the special fragment of adenoviral genome．These data suggest that the replication-deficient mouse IL-3 recombinant adenoviruses have been constructed successfully．
Key words Interleukin-3（IL-3），Adenovirus vector，Gene therapy
腺病毒具有宿主范围广、可感染分裂及静止期细胞、包装容量大、不发生整合、繁殖滴度高、性质稳定等优点，成为继逆转录病毒载体后被广泛应用的载体系统，主要用于in vivo基因转移［1］。白细胞介素-3（IL-3）具有较强的造血调控作用，能显著促进造血前体细胞的分化成熟［2］，且具有一定的免疫调节能力，可增强IL-2、IL-1的抗肿瘤效应［3，4］。因而，构建携带IL-3基因的重组腺病毒载体可用于促进造血功能重建及抗肿瘤免疫的基因治疗研究。
1 材料和方法
1.1 腺病毒载体系统 为E1区和E3区缺失的复制缺陷5型腺病毒载体，包括含鼠巨细胞病毒启动子（mCMV）的穿梭质粒pMH4和pBHG10（Microbix．Inc．Canada）。
1.2 细菌和细胞株 菌株DH5α（本室保存）。人胚肾细胞株293（上海二医大陈诗书教授馈赠），为转化有腺病毒E1区基因的包装细胞，使用代数在35代以下，培养在含有10％FBS的高糖DMEM培养基中。
1.3 质粒 pUC18-mIL-3质粒（第三军医大学分子生物学教研室提供），含有鼠IL-3基因的cDNA。
1.4 其他试剂 脂质体DOTAP试剂盒（宝灵曼），质粒DNA大量提取试剂盒（Promega），TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶及限制性内切酶等（宝灵曼、华美）。
1.5 鼠IL-3编码读框的克隆 以pUC18-mIL-3为模板经PCR扩增IL-3编码读框。扩增的5′引物为5′CTGAATTCATGGTTCTTGCCAGC3′（含设计的EcoRI位点），3′引物为5′TCGTCGACTTAACATTCCACGGTTCC3（含设计的SalI位点），所扩增的引物预计大小为517bp。PCR反应体积为50μl，引物浓度为0．4μmol／L，扩增参数为94°C90s、60°C90s、72°C60s，35个循环，72°C延伸7min。取10μl产物行1．5％琼脂糖凝胶电泳分析。
1.6 重组腺病毒载体的构建 构建流程如图1所示。以EcoRI＋SalI分别对pMH4及鼠IL-3cDNA的PCR产物行双酶切，经V型电泳槽回收后连接，连接产物转化DH5α，再以EcoRI＋SalI双酶切进行鉴定。将阳性重组子pMH4-IL-3与pBHG10质粒用DOTAP包裹（按DOTAP试剂盒说明）共转染293细胞，上层以0．5％琼脂覆盖，移至37°C、5％CO2、饱和湿度培养箱中孵育，8～15d后即可观察到病毒空斑的出现。质粒提取、酶切、连接、转化等均按分子克隆第二版操作。
图 1鼠IL-3重组腺病毒载体构建流程图
Fig 1Demonstrative illustration for the construction of mouse IL-3 recombinant adenoviral vectors
1.7 空斑的鉴定 采用PCR共扩增法。挑取空斑再感染293细胞，待293细胞出现细胞病变时取1ml培养液，经蛋白酶K消化、酚氯仿抽提、乙醇沉淀提取病毒DNA，采用上述IL-3编码读框PCR引物和腺病毒特有引物进行扩增。腺病毒特有引物序列如下：
P1：5′-TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG-3′
P2：5′-CATCTGAACTCAAATCGTGG-3′
PCR反应体积为50μl，引物浓度为0．4μmol／L，扩增参数为94°C90s、60°C60s、72°C60s，35个循环，72°C延伸7min。各取10μl反应产物经1．5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2 结果
2.1 鼠IL-3cDNA编码读框的克隆 通过PCR克隆到了517bp（含设计的限制酶识别序列）的鼠IL-3编码读框cDNA。
2.2 重组质粒酶切鉴定结果 pMH4-IL-3质粒经EcoRI＋SalI双酶切后获得正确大小的IL-3cDNA片段（见图2）。
图 2重组质粒的酶切分析
Fig 2Digestive analysis for the recombinant plasmid Lane 1：PCR marker
Lane 2：EcoRI and SalI digests of the recombinant plasmid
Lane 3：Plasmid pMH4
2．3 病毒空斑PCR扩增结果 经8～15d孵育后培养皿共出现7个空斑，提取其中4个分隔良好的空斑再分别感染293细胞，待出现明显细胞病变时提取病毒DNA进行双引物PCR扩增，结果均出现两条带（见图3），分别在517bp和861bp处，为阳性噬斑，即携带鼠IL-3基因的重组腺病毒。
图 3病毒空斑的PCR扩增结果
Fig 3PCR products of the adenoviral plaques Lane 1：PCR marker
Lane 2～5：Positive plaques
3 讨论
利用病毒具有与细胞表面受体结合并将其基因组导入宿主细胞的特性，将控制病毒复制的基因及部分病毒复制非必须基因去除后可制备成各种病毒载体。目前已开发的病毒载体主要有逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、单纯疱疹病毒载体等，其中，以逆转录病毒载体及腺病毒载体最常用。由于逆转录病毒载体能携带外源基因整合进靶细胞的基因组内，实现目的基因的长期稳定表达，因而主要用于ex vivo的基因治疗研究。但是，由于外源基因的插入有导致基因突变的危险，因此，具有潜在的遗传毒性。此外，逆转录病毒只能感染分裂增殖的细胞，且繁殖滴度低，性质不稳定，不能满足in vivo基因治疗的需要。
因腺病毒载体具有宿主细胞广泛、可感染静止及分裂期细胞、繁殖滴度高、性质稳定、包装容量大及不整合等优点，而成为继逆转录病毒之后被广泛应用的病毒载体，主要用于in vivo基因治疗研究。在本研究中，我们构建的AdCMVIL-3是E1、E3区缺失的复制缺陷5型腺病毒。由于E1区基因为腺病毒复制所必需，因此需要由转化了E1区基因的包装细胞即人胚肾293细胞提供反式补偿才能复制和扩增。这种复制缺陷的重组腺病毒仍具有感染靶细胞的能力但不发生复制，因而不会直接造成靶细胞的损害。
由于腺病毒基因组较大（36kb），不便于直接进行分子克隆，因此，在构建腺病毒载体时，通常将腺病毒基因组左端制备成含E1区缺失的穿梭质粒（如本研究采用的pMH4），将目的基因插入其多克隆位点后再与含腺病毒基因组的质粒（本研究采用pBHG10）共转染至293细胞内进行同源重组。由于在pBHG10中包装信号（Ψ）缺失不能被包装成病毒［5］，必须与含包装信号的pMH4重组后才能形成感染性病毒，因此，有重组病毒生成后形成的空斑大多为含有目的基因的阳性空斑。本研究中所筛选的4个空斑均为阳性，证实这种重组方法的有效性。
传统的重组腺病毒载体鉴定方法是通过提取腺病毒感染后产生病变的293细胞的DNA，经限制性内切酶消化鉴定［6］，操作较烦琐且灵敏度较低。本研究应用PCR共扩增技术，在同一PCR体系中加入IL-3基因特异性引物和腺病毒特异性引物，可迅速、准确地鉴定出阳性空斑。
IL-3是一种具有广谱造血刺激活性的造血生长因子，且具有一定的免疫调节能力。我们构建的AdCMVIL-3为E1、E3区缺失的第一代腺病毒载体，由于载体内保留的病毒基因可产生少量的病毒蛋白，从而引发机体的免疫反应，加之腺病毒载体固有的不整合的特性，因此，其介导的IL-3的表达将是短暂的。这一特性与放化疗造成的骨髓损伤为一过性的特点及肿瘤免疫治疗的需要相适应，因而可望用于促进造血功能重建及抗肿瘤免疫的基因治疗研究。
第一作者，男，35岁，博士，主治医师，讲师
参考文献
1 Richard C，Mulligan．The basic science of gene therapy．Science，1993，260：926
2 Metcalf D，Begley CG，Johnson GR，et al．Effects of purified bacterialy synthesized murine muti-CSF（IL-3）on hematopoiesis in normal mice．Blood，1986，68（1）：48
3 Lissoni P，Barni S，Tisi E，et al．In vivo biological results of the association between interleukin-2 and interleukin-3 in the immunotherapy of cancer．Eur J Cancer，1993，29A（8）：1127
4 Esandi MC，van Someren GD，Bout A，et al．IL-1／IL-3 gene therapy of non-small cell lung cancer（NSCLC） in rats using、cracked′ adenoproducer cells．Gene Ther，1998，5（6）：778
5 Bett AJ，Haddara W，Prevec L，et al．An efficient and flexible system for construction of adenovirus vectors with inserts or deletions in early regions 1 and 3．Proc Natl Acad Sci USA，1994，91：8802
6 Graham FL， Prevec L．Methods for construction of adenovirus vectors．Mol Biotechnol，1995，3：207
（1999-02-03收稿；1999-07-09修回）