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抗人P185erbB2单克隆抗体的制备及特性分析
免疫学杂志 2000年第2期第16卷 技术与方法
作者：杨 光 杨治华 孙立新 刘 军 陈 凤
单位：中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所细胞生物学及分子生物学研究室，北京 100021
关键词：erbB2；P185；单克隆抗体；杂交瘤
摘 要：目的制备可特异识别P185erbB2胞外区的单抗，选出亲和力较高并具有抑瘤作用的克隆。方法以高表达erbB2的人乳腺癌细胞系SKBR3免疫BABL/c鼠，用纯化的重组DNA表达的P185胞外区蛋白作为抗原，以间接ELISA方法筛选阳性克降。结果获得10株稳定分泌抗P185胞外区单抗的杂交瘤细胞株。4株为IgG1、1株为IgG3、5株为IgM，分别可识别P185胞外区3个不同表位，且只与天然形式的P185胞外区特异结合。其中4株IgG1类抗体可明显抑制SKBR3及SKOV3细胞增殖。免疫组化实验可使SKBR3及SKOV3细胞膜特异性染色，且可检出乳腺癌、卵巢庙等石蜡切片标本中erbB2高表达的阳性细胞。结论所获单抗可特异识别P185胞外区抗原，具有肿瘤诊断、判断预后及人源化改造后用于治疗的应用潜力。
分类号：R392．11 文献标识码：A
文章编号：1000-8861(2000)02-0141-03
Preparation and identification of monoclonal antibodies against P185erbB2
YANG Guang ,YANG Zhi-hua,SUN Li-Xin ,LIU Jun ,CHEN Feng(Department of Cytology and Molecular Biology,Cancer Institute，CAMS and PUMC，Biejing100021，China)
Abstract：Objective to prepare monoclonal antibodies(McAbs)specifie to extracellular domain(ECD)of p185erbB2,and identifv high-affinity McAbs inhibiting tumor cell proliferation．Methods bABL／c mice were immuniaed with SKBR3cell line highly expressing P185．Hybridoma cell lines were screened by indirect ELISA using ECD of Pl85 recomblinant protein as antigen．Results ten hybridoma cell lines were obtained,McAbs recognized only three different epitopes of natura P185，Ig subctass of McAbs were consisted of four IgGl，one igG3，five igM．McAbs of four IgGl inhibit markedly proliferation of SKBR；and sKOV cell lines，Immunohistochemistry assay demonstrated McAbs C25 recognized specifically membrane of SKBR3,SKOV3 cell lines and breast，Dvarian cancer cells，etc．In paraffin sections．Conclusion these McAbs against P185 may be beneficial to cancer diagnosis，prognosis and cancer therapy.
Keywords：erbB2；P185：monoclonal antibody：hybridoma
P185是erbB2也称HER2/neu基因编码的具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白,属于表皮生长因子受体家族的成员。P185在乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、胃癌、肺癌等多种上皮细胞来源的恶性肿瘤中过度表达，其表达越高，肿瘤的恶性程度越高、对化疗越不敏感，患者的存活期缩短，越易出现复发、转移[1,2]。因此以P185为靶抗原的抗体介导的生物治疗正受到人们的极大关注。国外抗P185单抗已研制成功并用于肿瘤的诊断、预后，1998年10月美国FDA已正式批准抗P185人源化抗体用于临床治疗P185高表达的乳腺癌[3]，而国内这方面工作尚属空白。我们制备了抗P185胞外区单抗以期在肿瘤诊断、预后等方面得到应用并为研制能用于临床治疗的抗P185基因工程抗体打下基础。
1材料和方法 1.1试剂、动物及细胞PEG400，HAT，ProteinASepharose4B-FastFlow胶，MTT，均为Sigma产品。胎牛血清为Hyclone产品，实验对照抗体：抗P185胞外区单抗L87为NeoMarkers公司产品。125I同位素为DewEngland产品。羊抗鼠IgG-HRP为SantaCruz产品。免疫组化SP试剂盒为ZYMED产品。6～8周龄BABL／c小鼠由本所动物室提供。小鼠骨髓瘤细胞SP2／0-Ag14及高表达P185的人乳腺癌细胞SKBR3、人卵巢癌细胞SKOV3为本室保存培养。1.2杂交瘤的制备以SKBR3细胞免疫BABL/c小鼠，按常规方法制备杂交瘤。用含有人erbB2胞外区基因的重组质粒转化大肠杆菌DH5α，诱导表达并纯化后作为包被抗原，采用间接ELISA方法筛选阳性克隆。
1．3腹水的制备及抗体的纯化石蜡油致敏BABL/c小鼠3天后，腹腔接种3×106杂交瘤细胞制备腹水。属于IgG类单抗经ProteinASepharose-4BFastFlow柱纯化；属于IgM类单抗用简易正辛酸法纯化。纯化后的单抗经SDS-PAGE胶电泳鉴定纯度。
1．4单抗特性分析 1．4.1抗体的类及亚类分析：取培养上清用IsoDe-tectTM单抗表位试剂盒(Stratagene公司)测定。
1．4.2单抗的亲和常数测定及识别抗原表位分析：按文献[4]用氯胺-T法以125I标记纯化的P185胞外区单抗，以固相竞争放射免疫法进行抗体的亲和常数测定和表位分析。
1．4．3单抗识别抗原特性分析：分别以变性和复性形式的P185胞外区蛋白包被，常规间接ELISA法测定自制单抗与这两种抗原的反应能力。WesternBlot是用复性后的P185胞外区蛋白在PAGE胶中分别进行非还原和还原电泳，采用半干式电转移法进行。
1.5细胞增殖实验按1×104个SKBR3或SKOV3细胞/孔加入96孔板中，次日弃培养液加入含抗体(终浓度20μg/ml)培养液维持5天后，吸弃培养液加入含MTT的培养液培养4～6h，以含10%SDS的0．01mol／LHCl裂解细胞，测OD570/530。依下列公式计算抑制率：抑制率＝(1-实验组OD值／对照组OD值)×100% 1.6免疫组化将SKBR3或SKOV3细胞培养在盖玻片上,丙酮固定、H2O2-甲醇液处理、封闭后加P185单抗,以羊抗鼠IgG-HRP为二抗，DAB显色，苏木精复染，经脱水、透明后封片。选用C25单抗以SP法对乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、食管癌、胃癌的石蜡切片标本进行染色。
2结果 2．1抗P185胞外区单抗的基本特性经过4～5轮亚克隆筛选出10株分泌抗P185胞外区单抗的杂交瘤细胞株，经3～6个月传代及反复冻存、复苏后仍稳定地分泌抗体。抗体的基本特征见表1。
2．2识别抗原特性分析ELISA结果显示自制单抗与复性后P185抗原结合而与变性形式P185抗原结合能力很弱，这与用C25单抗进行WesternBlot 表1抗P185胞外区单抗的基本特性 Tab1CharacteristicsofMcAbsagainstP185erbB2ND：notdetect 结果相吻合，该单抗与还原电泳中P185胞外区抗原反应能力很弱(免疫染色带很浅)，而与复性后非还原电泳中P185胞外区抗原反应出现单一免疫染色带，见图1。
图1C25单抗识别P185胞外区抗原的WesternBlot分析 Fig1WesternblotofC25McAbrecognizingextracellulardomain(ECD)ofP185 a：Mid-rangeproteinmolecularmarker(Promega)
b：non-reducedECDofP185stainedbyC25McAb 2．3单抗对SKBR3及SKOV3细胞增殖的影响单抗C12、C23、C25、C41对SKBR3或SKOV3细胞的增殖有明显的抑制作用，抑制率分别达到SKBR356．3%、52．7%、60．63%、52.7%；SKOV3：35．1％、32．5%、35.1％、31.6%。其余单抗对SKBR3或SKOV3细胞的增殖抑制不明显，抑制率在9．5%～14％之间。各单抗对NIH/3T3细胞的增殖无影响。
2．4免疫组化染色用自制单抗C25进行SKBR3、SKOV3培养细胞的免疫组化染色可见特异性膜阳性染色，而相同条件下NIH/3T3细胞和人骨髓基质细胞(HFCL)染色均为阴性。用商品抗体L87进行对照实验结果SKBR3细胞膜染色较弱。用C25单抗以SP法对乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、食管癌、胃癌的石蜡切片标本进行染色，详细结果另文报道。其中乳腺癌阳性率为35%，与文献[2]报道相似。阳性细胞可见特异性膜染色，有些细胞可见胞浆着色，见图2。
图2C25单抗对礼腺癌石蜡切片的SP免疫组化染色(×100)
Fig2SpecificimmunohistochemistrystainsofC25McAbto185positivecellofbreastcancer(×100)
3讨论 近年来国内外大量研究证实P185在多种上皮来源的恶性肿瘤中过度表达，阳性率占各种肿瘤的10%～60%不等，且与预后及疗效关系密切[1,2]。可以说P185过度表达是肿瘤恶化的一种标志，与肿瘤的转移、复发有关。同时P185也是引起肿瘤细胞抵抗化疗和激素治疗的重要原因之一，有报告说明血清中高水平的P185胞外区片段是原发瘤P185过度表达的表现，与肿瘤的转移有关[2]。因此,P185单抗不仅在肿瘤的诊断、预后及基础研究中有重要的应用价值,而且也是肿瘤生物治疗的效应分子和理想的导向载体。因此制备高效、特异的P185单抗及进一步的人源化改造将具有重要的临床应用价值。
本研究所获得的P185胞外区单抗是用P185高表达的SKBR3细胞进行免疫，为了减少交叉反应获得高特异的抗P185单抗，本文采用DNA重组表达了P185胞外区蛋白、纯化后，作为包被抗原，用ELISA方法筛选阳性克隆。用固相竞争放射免疫方法分析所识别的抗原表位，结果表明10株抗体，可识别3种不同的P185胞外区抗原表位，且均与商品单抗L87所识别的表位不同。ELISA及WesternBlot检测了这些单抗与变性和复性后两种形式P185胞外区抗原的结合能力，表明自制单抗只识别复性形式P185胞外区抗原，而不能与变性形式的P185胞外区抗原结合。结合免疫组化染色的结果,表明自制单抗只识别天然形式P185胞外区，比用重组P185胞外区蛋白免疫制备的商品单抗L87与天然形式的P185蛋白结合能力更强，因此，本文制备的单抗更适合应用于肿瘤的诊断及治疗，显示出良好的应用前景。
细胞增殖实验结果表明，自制单抗对SKBR3、SKOV3细胞有明显的抑制作用，而对NIH／3T3细胞的增殖无明显影响，说明抗体对细胞增殖的影响是具抗原特异性的，其抑制率与国外文献[5]报道相似。有研究表明不同的P185单抗对肿瘤细胞的生长具有不同的作用，有些单抗可抑制肿瘤的生长，而另一些单抗则可促进肿瘤的生长[6]，推测是由于不同的单抗所识别的P185分子的表位不同。P185单抗对肿瘤生长的抑制作用可能是由于单抗阻断了P185的酪氨酸磷酸化信号传递过程[7]。本研究制备的单抗在体内对肿瘤细胞生长的作用有待于在裸鼠人移植瘤的进一步实验，这方面的工作目前正在进行之中，一旦证明其有抑制作用,我们将进行基因工程的改造，研制适合人体应用的人源化抗体。
作者简介：杨 光(1964-)，男，辽宁沈阳市人，副教授，博士研究生，主要从事肿瘤分子生物学及肿瘤的免疫防治的研究。参考文献：
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收稿日期：1999-07-06
修稿日期：1999-10-26