HLAⅡ类基因PCR-SSP分型技术在骨髓移植配型中的应用

HLAⅡ类基因PCR-SSP分型技术在骨髓移植配型中的应用

免疫学杂志 2000年第2期第16卷 技术与方法

作者：聂向民　王 潍　徐 群　张世训

单位：山东省血液中心，山东 济南 250014

关键词：HLA；PCR-SSP；移植配型

　　摘　要：目的建立快速、准确的HLA基因分型方法，满足临床移植配型的需要。方法通过序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)，对拟行骨髓移植的10例血液病患者及12名相关供者的HLA-Ⅱ类基因DRB1,DQB1位点扩增，琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物并确定其基因型：结果发现2例患者与其相关供者HLA-DRB1，DQB1基因全相同，其中1例成功进行了骨髓移植。结论该方法具有快速准确、特异性高、简便省时的特点。

　　分类号：R392．13　文献标识码：A

　　文章编号：1000-8861(2000)02-0148-03

HLA-Ⅱ genotyping by PCR-SSP technique in application of bone mar-ron transplantation

NIE Xiang-min ,WANG Wei,XU Qun ,ZHANG Shi-xun(Shandong Blood Center，Jinan250014，China)

　　Abstract：Objective to establish a rapid，accurate hLA DNA typing method in application of BMT．Methods with the use of polymerase chain reaction-sequence specific primers(PCR-SSP)．We amplified the DRB1 and DQB1 loci of 10 patients planning to take BMT and 12 potential related donors，and identified their genotype by analysis of amplification products with agarose gel electrophoresis．Result among these patients.2 cases matched with their donors and one took BMT successfully.Conclusions This method is rapid，accurate，high-specific and convenient．

　　Keywords：HLA；PCR-SSP；tissue typing

　　HLAⅡ类基因是位于人类第6对染色体短臂远端的一组高度多态的基因，主要包括HLA-DR、DQ、DP3个亚区。骨髓移植现已被接受作为治疗血液系统恶性疾病、骨髓衰竭、某些遗传病及免疫缺陷的手段。对于慢性粒细胞性白血病(CML)患者，继大剂量化疗后采用骨髓移植可使50％～70%病例治愈[1]。HLAⅡ类基因配型对提高异基因骨髓移植存活率，减少GVHD，具有重要意义[2]。既往HLAⅡ类分型采用血清学微量淋巴细胞毒试验，近年国外实验室已转向基因分型,并已将其列为常规。我们采用序列特异性引物(SSP)PCR技术对HLA-DR、DQ进行基因分型，快速简便，现报告如下： 1材料和方法 1.1样本山东医科大学附属医院提供10名拟行骨髓移植的恶性血液病患者及其12名相关供者样本。

　　 1.2DNA提取抽取静脉血1ml，EDTA抗凝，2000g离心取白膜层加入红细胞裂解液(NH4CL6．35g／L，EDTA1.33g/L，Tris0．92g/L)，充分裂解红细胞，离心弃上清液，取白细胞沉淀加入蛋白酶K(10μg／μl)25μl，7.5mol盐酸胍200μl，10%SDS200μl，双蒸水200μl，70℃震荡水浴20min，高速离心，取上清液，加入2.5倍体积预冷无水乙醇沉淀DNA，溶于Ph8．0TE溶液中备用。

　　 1.3序列特异性引物包括17对DR引物,5对DQ引物及1对内对照引物。参照第12届国际HLA会议提供的DNA序列和文献[3，4]设计,由北京市血液中心提供。其中15对DRB1引物和5对DQB1引物为组特异性或等位基因特异性，另有2对DRB3、DRB4基因特异性引物，它们分别与不同的DRB1等位基因关联，有助于结果分析与质量控制。全套引物可包括DR、DQ位点的全部血清学特异性；DRB1.01，DRB1*15，DRB1*16，DRB1*03，DRB1*04，DRB1*11，DRB1*12，DRB1*07，DRB1*08，DRB1*09．DRB1*10，DRB1*13．1，DRB1*13．2，DRD1*14．1，DRB1*14．2，DRB3，DRB4及DQB1*0201，DQB1*03，DQB1*04DQB1*05，DQB1*06。

　　 1．4PCR扩增美国PE公司2400基因扩增仪。扩增体系25／μl,包括10×PCR扩增缓冲液2．5μl，表122例移值供受者PCR-SSP分型结果 Table1GenotypingresultscheckedbyPCR-SSP SamplesGenotypeProductsizes(bp)Phenotype patient1DRB1*04,DRBI*07,DRB4269,233,222DR4,DR7 DQB1*0201,DQB1*03214，79DQ2,DQ3 donor1DRB1*04,DRB1*09,DRB4269,180,222DR4,DR9 DQB1*0379DQ3 patient2DRB1*11,DRB1*15,DRB3177,205,240DR11,DR15 DQB1*03,DQB1*0679,81DQ3,DQ6 donor2DRB1*14a,DRB1*15,DRB3210,205,240DR14,DR15 DQB1*05,DQB1*06225,81DQ5,DQ6 patient3DRB1*09,DRB1*15,DRB4180,205,222DR9,DR15 DQB1,03,DQB1*0679,81DQ3,DQ6 donor3DRB1*04,DRB1*11,DRB3,DRB4269,177,240,222DR4,DR11 DQB1*0379DQ3 patient4DRB1*08,DRB1*13a,DRB3222,137,240DR8,DR13 DQB1*0681DQ6 donor4DRB1*08,DRB1*11,DRB3222,177,240DR8,DR11 DQB1*03,DQB1*0679,81DQ3,DQ6 patient5DRB1*04,DRB1*15,DRB4269,205,222DR4,DR15 DQB1*04,DQB1*06192,81DQ4,DQ6 donor5-1DRB1*04,DRB1*11,DRB3,DRB4269,177,240,222DR4,DR11 DQB1*03,DQB1*0479,192DQ3,DQ4 donor5-2DRB1*09,DRB1*15,DRB4180,205,222DR9,DR15 DQB1*03,DQB1*0679,81DQ3,DQ6 patient6DRB1*09,DRB1*10.DRB4180,213,222DR9,DR10 DQB1*03,DQB1*0579,225DQ3,DQ5 donor6DRB1*10,DRB1*12,DRB3213,110,240BR10,DR12 DQB1*05,DQB1*03225,79DQ3,DQ5 patient7DRB1*04,DRB1*09,DRB4269,180,222DR4,DR9 DQB1*0379DQ3 donor7-1DRB1*10,DRB1*12,DRB3213,Il0,240DR10,DR12 DQBI*03,DQBI*0579,225Dq3,DQ5 donor7-2DRB1*09,DRB1*10,DRB4180,213,222DR9,DR10 DQB1*03,DQB1*0579,225DQ3,DQ5 patient8DRB1*11,DRB1*15,DRB3177,205,240DR11,DR15 DQB1*03,DQB1*0679,81DQ3,DQ6 donor8DRB1*11,DRB1*15,DRB3177,205,240DR11,DR15 DQB1*03,DQB1*0679,81DQ3,DQ6 patient9DRB1*09,DRB1*14a,DRB3,DRB4180,210,240,222DR9,DR14 DQB1*03,DQB1*0579,225DQ3,DQ5 donor9DRB1*09,DRB1*14a,DRB3,DRB4180,210,240,222DRO,DR14 DQB1*03,DQB1*0579,225DQ3,DQ5 patient10DRB1*04,DRB1*15,DRB4269,205,222DR4,DR15 DQB1*04,DQB1*06192,81DQ4,DQ6 donor10DRB1*04,DRB1*07,DRB4269,233.222DR4,DR7 DOB1*04,DOB10201192,214DQ4,DQ225mmolMgCl2，1.5μl，2mm4×dNTPs2．5μl，模板DNA50ng，TaqDNA聚合酶1U(美国Pro-mega公司)。PCR扩增参数为：94℃预变性2min进入PCR循环：94℃40s，64℃40s，72℃40s，35个循环后继续延伸2min，降温至4℃。

　　 1．5结果检测以1.5%琼脂糖凝胶(含0．51μg/ml溴乙锭)，0．5×TBE电泳缓冲液电泳,302nm波长紫外线透射仪下分析结果。

　　 2结果 22例骨髓移植供受者HLA-DR、DQ基因分型结果见表1。根据22例移植供受者HLAⅡ类基因分型结果分析,在22例移植供受者中，有2例供者与患者HLA-DR、DQ位点全相合，占供者的1/6(2／12)；1例供受者全不相同；8例供者与患者为半相合，占供者的2／3(8／12)。根据遗传法则，同胞之间的相关供者,全相合及全不相同的机率各为1/4，半相合的机率为1／2。由于本组患者及供者数较少，尚不能与理论数值相符。

　　 3讨论 HLA基因位于人类第6号染色体短臂6P23．1片断上，全长3500kb，是迄今已知的具有最复杂多态性的人类遗传标记。其主要功能是参与自我识别,介导免疫反应和对异体移植物的排斥作用。DR区有1个功能性α链基因(2个等位基因)及4个功能性β链基因DRB1，DRB3，DRB4和DRB5，4个功能性β链基因是全部血清学特异性(DR1～DR18，DR52，DR53)的基因密码。HLA-DQ区有2个DQA基因和3个DQB基因(DQB1,DQB2，和DQB3)。其中DQA1和DQB1为结构基因，DQ的表型是由DQB1决定的[5]。

　　 器官移植配型中重要的是了解供受者之间的HLA基因型是否相同。血清学表型相同者基因型不一定相同，每一种血清学特异性有若干等位基因型，而基因型则比血清型更具多态性。分析被检标本的基因型比检定血清学表型更准确。骨髓移植供受者之间HLA抗原1个氨基酸的差异即可能引起急性排斥反应[6]。HLA配型已成为控制移植物存活率尤其是长期存活率的最显基因之一。

　　 传统的血清学HLAⅡ类分型方法国高质量的定型血清来源困难，存在交叉反应，对抗原特异性确定有出入。而且血清学表型的判定还受分离B淋巴细胞的纯度与活力、补体质量等因素的影响,导致比较高的分型错误率[7]。并且，血型学分型需新鲜血样至少10ml以上，婴幼儿或特殊患者取材困难。李哲先等分析14个实验室15组HLA-DR、DQ血清学分型数据，发现不同实验室存在非常显著的差异(P＜0．001)[8]。SCHERERS等报告血清学HLA分型与PCR分子生物学检测方法的符合率仪为70％～80%左右[9]。与其比较，PCR-SSP具有特异性高、简便省时的优点。由于TaqDNA聚合酶缺乏3’→5’外切酶的活性,不能延伸3’末端错配的引物，因此在严格的扩增条件下，每个扩增体系的1对引物必须与等位基因2个顺式连接的多态性区域完全匹配才能延伸，确保了PCR扩增的特异性。另外，PCR-SSP分型避免了其它一些基因分型方法在PCR扩增后的杂交、酶切等步骤，结果直观，便于分析，是血清学和其它一些PCR基础上的基因分型方法难以比拟的。在以上标本中，患者8、患者9与其供者DR、DQ基因型全相同，且HLA-A、B位点血清学分型亦相同。其中，患者8成功地进行了骨髓移植，移植后情况良好，未出现严重排斥反应。

　　 (致谢：感谢北京市血液中心HLA实验室张志欣教授、单小燕老师的大力支持与帮助!)

　　作者简介：聂向民(1969-)，男，浙江常山县人,住院医师,本科，主要从事HLA及人类血型学的研究。参考文献：

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　　［3］BONDMER JG，MARSH SGE．PARHAM P．Et al．HLA classⅡ region nucleotide sequences[J].Tissue Antigens，1995，46(1)：1～18

　　［4］OLERUP O，ALDEMERA，FOGDELL．A．HLA-DQB1 and DQAl typing by PCR amplification with sequence-specific primers (PCR-SSP)in 2 hours[J]，Tissue antigens，1993，41(1)：119～134．

　　［5］BONDMER JG，MARSH SGE．PARHAM P，et al．HLA class Ⅱ region nucleotide sequences[J]．Tissue Antigens，1995．46：258～280．

　　［6］FLEISCHHAUER K．KERNAN NA．O'REILLY RJ，et al．Bone marrow-allograft rejection by T lympho-cytes recongmzing 3 single amino acid difference in hLA-B44[J]．New Engl J Med，1990，323：1818～1825.

　　［7］WILLEM V，ILIAS IN，ANHOLTS J．Biotinylated DRB sequence-specific of oligonucleotides comparision to serologic HLA-Drtyping of organ donors in euro-transplant[J].Human Immunol，1993，37：59～67.

　　［8］李哲先，贾宝祥，尔秀江．关于我国HLA-DR,DQ位点抗原多态性血清学研究的分析[J].中国免疫学杂志，1994．10：317～319．

　　［9］SCHERER S，MYTILINEOS J DUNCKLEY H，et al．Analysis of rare HLA-DRB1，DQA1 haplotypes in kidney donors and rectpients[J]．Human Immunol，1995，44：89～90.

收稿日期：1999-04-12

修稿日期：1999-10-20