冻干水化（DRV）型脂质体作为免疫佐剂可行性的研究

冻干水化（DRV）型脂质体作为免疫佐剂可行性的研究

免疫学杂志 2000年第3期第16卷 基础免疫学

作者：费丽华　李力　林星石　袁玫

单位：费丽华（解放军总医院肿瘤生物学室，北京　100853）；李力（解放军总医院肿瘤生物学室，北京　100853）；林星石（解放军总医院肿瘤生物学室，北京　100853）；袁玫（解放军总医院肿瘤生物学室，北京　100853）

关键词：免疫佐剂；脂质体；肿瘤疫苗

　　［摘　要］目的　对DRV型脂质体作为免疫佐剂的可行性及稳定性进行研究。方法　改良的DRV型脂质体的制备；并用ELISA、MTT法、皮肤迟发型过敏反应（DTH）及整体的抑瘤试验；TBA法、碘值、氧化指数和气质联用分析法进行鉴定。结果　①DRV型脂质体能增强小鼠对抗原（粘液糖蛋白、核心多肽及基因肽）的体液免疫和细胞免疫；疫苗免疫后C57小鼠有杀瘤作用（对照组89％成瘤，疫苗组为40％）。②DRV型脂质体在低温、密闭、避光条件下储存，稳定期在1年以上。结论　DRV型脂质体能增强机体对抗原的体液免疫和细胞免疫，可作为肿瘤疫苗的免疫佐剂。

　　［中图分类号］R392　　［文献标识码］A

　　［文章编号］1000-8861（2000）03-0193-03

Experimental study of feasibility of dehydration-rehydration vesicles（DRV） type liposome as a immune adjuvant

FEI Li-hua，LI Li，LIN Xin-shi，YUAN Mei

　　（Cancer Research Laboratory，General Hospital of PLA，Beijing 100853，China）

　　［Abstract］Objective To investigate the feasibility and stability of DRV type liposome to be used as a immune adjuvant.Methods Preparation of DRV type liposome；It is measured by ELISA and MTT，DTH response and inhibited tumor experiment in vivo.TBA，iodometric method，oxidative index and gas liquid chromatography.Results ① The DRV type liposome could enhance specific humoral and cellular immune response of BALB／c mouse to encapsulated antigen （mucus glycoprotein，mucin polypeptide and gene petide）.Mucus glycoprotein vaccine was used immunotherapy against tumor.89％ mice of control group were bearing tumor.40％ mice of vaccine group were bearing tumor；MUC-3 vaccine could induce humoral immune response of BALB／c mouse，produce 7～8 hybridoma cell line.② DRV type liposome is stable in conditions of low temperature，airtight and no light to keep original oxidative state and immune activity.The stable time is above 1 year.Conclusion DRV type，liposome could enhanse the humoral and cellular immune response of BALB／c mouse to encapsulated antigen.

　　［Key word］immune adjuvant；liposome；tumor vaccine

　　肿瘤疫苗是肿瘤生物治疗中一种很有前途的治疗手段。免疫佐剂是疫苗中必不可少的辅佐成分。脂质体的免疫佐剂作用逐渐被认识，已用于艾滋病疫苗的免疫佐剂^［1］。本文以DRV（冻干水化）型脂质体为免疫佐剂，从诱发BALB／c小鼠的免疫功能及氧化程度等方面作可行性和稳定性研究。

　　1　材料与方法

　　1.1　试剂与仪器　试剂：卵磷脂（BP）购自天津卫生材料厂（批号901004）；胆固醇（BP）系Holland产品，由北京化学试剂公司分装。仪器：旋转蒸发仪ZFQ型系天津玻璃仪器厂产品。

　　1.2　DRV（dehydration-rehydration vesicles）型疫苗的制备　参照文献［2］的方法原理进行改良。将传统多层脂质体（MLV，multilamellar vesicles）的无抗原悬液直接和抗原、冷冻保护剂混合、冻干、临用前加入溶酶，Vertex即成DRV型疫苗。无抗原者即为DRV型脂质体。经鉴定：是直径在0.2～1μm的圆形或椭圆型多层脂膜囊，包裹可溶性蛋白百分率可达70.4％。与MLV型的形态和包裹率（79％±6.0 ％）近似。

　　1.3　体液和细胞免疫测定方法　ELISA法测定血清抗体的效价和亚型；MTT法测定补体介导下的抗体细胞毒；皮肤迟发型过敏反应（DTH）和疫苗免疫小鼠的整体抑瘤效果。

　　1.4　脂氧化程度测定方法　按文献［3～5］方法测定丙二醛（MDA）含量、碘值、氧化指数和脂肪酸组成。

　　2　结果

　　2.1　可行性　由DRV型脂质体的可行性，观察3种可溶性蛋白疫苗的免疫作用。大分子粘液蛋白疫苗：

　　2.1.1　诱发机体体液免疫：由BALB／c小鼠免疫后时间和血清抗体效价的关系曲线显示：佐剂组无抗体产生，抗原和疫苗组都产生抗体，效价也相似，其滴度分别为1∶2×10⁵和1∶4×10⁵。疫苗组在免疫3次后（约30d）抗体效价开始增高，时间约比抗原组提前1周。

　　抗体亚型：小鼠免疫后0和55d血清抗体亚型含量比较，发现疫苗和抗原组55d　IgG含量明显增高，疫苗组增高的量（56％）明显高于抗原组（36％），两组差异显著（P＜0.005）；而IgM含量，抗原组增高明显（58％），疫苗组不显著。这说明疫苗组免疫后产生的抗体以IgG为主，而单纯抗原组以IgM为主。

　　抗体的特异性：疫苗组小鼠的血清抗体可被特异抗原抑制（95.8％±2.1％），而抗原组则低（84.9％±4.9％），两组差异显著（P＜0.001）；疫苗组血清抗体与表达特异抗原的人肿瘤细胞株（胃癌细胞系KATOⅢ、肠癌细胞系Ls174T和SW1116）有免疫反应（ELISA测定A490分别为0.465、0.435和0.566），而与无特异抗原的肿瘤细胞系（7721）则无反应。与表达特异抗原的胰腺癌组织有阳性反应，镜下可见肿瘤细胞膜和浆内均有棕色颗粒。对正常人组织（肝、肺、肾、肌肉和小肠等）没反应。

　　补体介导下抗体细胞毒：疫苗组50％小鼠和抗原组43％小鼠的血清抗体在补体介导下有细胞毒作用。其杀瘤率都不高，疫苗组（26％±6％）比同剂量的抗原组（15％±4％）稍高。

　　2.1.2　细胞免疫

　　DTH：疫苗组小鼠在抗原攻击后55h脚掌肿胀全部消退，而抗原组在30h全消退，佐剂组无肿胀。表明疫苗组有DTH反应，抗原组则无。

　　脾淋巴细胞体外增殖：疫苗组小鼠的脾淋巴细胞与抗原共培养时，不断增殖形成许多细胞团，在44d时可达原有细胞密度的12倍。抗原组小鼠的脾淋巴细胞则随体外培养时间延长，增殖变慢、停止甚至死亡。细胞仅能维持14～19d。

　　整体抑瘤：C57小鼠在疫苗免疫3次时接种Lewis肺癌细胞系，疫苗0.5～3.0μg均有抑瘤作用。以1.0μg组为例，30d的成瘤率（40％）明显比对照组低（89％），对照组小鼠31d的死亡率（33％）比疫苗组（0％）高。

　　2.2　粘液核心多肽（Muc-3）　小分子肽类Muc-3，MW为1771u，17个氨基酸，难以直接激活机体的免疫功能，因此需要选择合适的佐剂。在国外Kim实验室，将它连接钥孔原虫血兰素（KLH）也不能激活机体的免疫系统产生抗体。我们用DRV型脂质体包裹合成的Muc-3和KLH的连接物组成的疫苗，免疫BALB／c小鼠后产生了抗体，并制备出7～8株单抗。

　　2.3　p53突变基因肽　协和医科大学博士生黄蓝青^［6］用抗原（p53突变基因肽）和我室自制的DRV型脂质体混合，免疫C57小鼠，产生细胞免疫，激活CTL细胞，效靶比25∶1，其溶瘤率可达60％，而用不完全佐剂（IFA）的为40％，Detox为70％，并证实这些CTL细胞是CD8阳性的T细胞。

　　2.4　稳定性

　　2.4.1　氧化程度测定

　　MDA含量：－30°C冰箱内储存了595d疫苗的MDA含量均值是0.39μg／瓶（1.7～5.3nmol／L）。国产卵磷脂（原材料）的是0.37μg／瓶。结果表示保存595d疫苗的MDA含量与原材料是相似的。

　　氧化指数：储存了518d疫苗的氧化脂指数是0.68，比原材料的（0.51）高。

　　碘值：保存了644d和389d疫苗的碘值均为92，比原材料的碘值（82.5）高。

　　GC／MS分析：分析结果显示国产卵磷脂的脂肪酸的组成和百分含量与Sigma公司生产的很相近（见表1）。在室温20°C短期储存（56d）影响不大。低温储存一年多的疫苗则有较明显的变化，硬脂酸含量增高了一倍多。

表1　卵磷脂和疫苗中各脂肪酸的百分含量

　　Tab1　Percent fatty acid component of in lecithin and vaccine

Fatty acid name	Lecithn			Vaccine
	Ref	Sigma	Tianjinga	70db＋	70db	398dc
16∶0 Palmitic	37.7	41.5	41.0	41.7	43.1	25.7
16∶1 Palmitoleic	3.1	0.7	1.8	1.4	1.5	0.8
18∶0 Stearic	9.2	13.3	15.7	17.0	16.2	42.8
18∶1 Oleic	32.9	29.2	26.7	25.9	17.7	25.5
18∶2 Linoleic	17.0	13.4	12.6	12.6	8.3	12.0
20∶4 Arachidonic		1.8	2.2	1.4	4.7	1.5

　　*：J Am.Oil Chemiste’Society.1965，42：53.Value in table is average of two sample.＋：Stored at 20°C for 56d；Lot number：a-901004，b-951130，c-950106.2.4.2　影响疫苗稳定性因素的探讨：疫苗经①在－30°C冰箱内避光、密闭保存1年以上（对照）；②瓶外10cm处紫外线照射1h；③启盖后在室温20°C的干燥器内存放3d；④37°C温箱放置42h。疫苗受到紫外线照射及与氧接触后的MDA含量均增高40％以上；37°C存放使疫苗中的抗原免疫活性丢失了32％。由此可见疫苗制备、保存和运输中需低温和密闭，并应避免紫外线（日光）直接照射。

　　2.4.3　疫苗稳定期的测定：将低温、避光、密闭保存不同时间的疫苗分别测定其抗原与抗体反应的免疫活性和MDA的含量。储存410d疫苗的抗原免疫活性有所降低，约为原始的70％。MDA含量则无变化，详见上述结果。由此估算疫苗在这特定条件下的稳定期为1年。

　　3　讨论

　　脂质体在疫苗免疫佐剂的应用，关键在于它对抗原的包裹率、渗漏率及稳定性。文献报道薄膜法制备的免疫脂质体包裹率高达70.1％，但有渗漏，并不稳定。为了保证其效果须临用前制备^［8］，因此严重影响脂质体在医学和药学上的应用前景。本文DRV型脂质体有文献相似的包裹率，而渗漏可忽略、稳定期又较长。是它用作疫苗免疫佐剂的根本基础。

　　本文证明自制的DRV型脂质体，本身无毒、无免疫原性、可被机体自然降解；能协助抗原刺激并激活T、B淋巴细胞，诱发了机体的体液免疫和细胞免疫。活化巨噬细胞发挥其提呈抗原功能。使免疫系统充分发挥作用增进杀伤肿瘤的能力。这和文献报道脂质体作为免疫佐剂的特点十分相似^［9］。

　　脂质体的稳定性是影响其应用前景的主要因素。DRV型脂质体是以卵磷脂为原料。它的氧化程度是影响其稳定性的一个重要因素。其氧化的最终产物是对人有毒的，因此对人的安全性就直接影响其应用。目前已明确，它氧化的最终产物主要为4-Hydroxynonemal（HNE）、MDA和其他醛类^［10］。本文已证明保存了1年多的DRV型疫苗，保持了它包裹时抗原的免疫活性和磷脂的氧化状态。它们的碘值是在我国药典的规定范围（79～128）内，MDA浓度也大大低于正常人尿MDA浓度水平（0.2μmol／L到0.8μmol／L）^［10］。这说明在低温密闭避光的条件下储存1年DRV型脂质体是安全的。这样为它在今后的临床应用提供一个广阔的前景。

　　［基金项目］国家自然科学基金资助项目（39570821）

　　［作者简介］费丽华（1943-），女，浙江吴兴县人，高级实验师，中专，主要从事肿瘤免疫研究。

　　［参考文献］

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　　［5］李邝杞，徐宁宁，陆效平，等.卵磷脂质量对甲氨喋呤(MTX）脂质体包裹率的影响［J］.药学学报，1982，17：218～221.

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　　［10］ESTERBAUER H，SCHAUR RJ，ZOLLNER H.Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal，malonaldehyde and relatedaldehydes［J］.Free Radical Biology ＆ Medicine，1991，11：81～128.

［收稿日期］1999-10-26；［修回日期］1999-02-14