重症肌无力特异性细胞免疫应答

重症肌无力特异性细胞免疫应答

免疫学杂志 2000年第2期第16卷 中国免疫学会首届青年学术会议优秀论文选登

作者：国 红　孙 宏　许贤豪　王 红　张 华　李宝林

单位：卫生部北京医院神经科，北京 100730

关键词：重症肌无力；干扰素-γ；白细胞介素-4

　　摘　要：目的了解重症肌无力(MG)特异性细胞免疫应答情况。方法采用酶链免疫吸附试验(ELISA)和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)结合狭缝印迹杂交检测MG患者及健康对照者的PBMC和胸腺细胞AChR刺激后IFNγ和IL4的表达及转录，并对行胸腺摘除(Tx)者进行了随访。结果总MG患者组PBMC IFN-γ表达高于对照,尤以急性MG更著。增生的胸腺细胞IFN-γ、IL—4转录和IL-4的表达高于对照，胸腺细胞和PBMC的IL-4转录明显相关。Tx1周后PBMC IL-4的表达减少,1月后IFN-γ转录下降。结论 MG患者体内存在特异性细胞免疫活化和细胞因子网络的失衡，PBMC有些免疫学参数能反映胸腺的免疫学改变；胸腺增生和胸腺瘤的MG发病机制可能不同；Tx及其后应用糖皮质类固醇治疗是必要的。

　　分类号：R746．1;R322．5　文献标识码：A

　　文章编号：1000-8861(2000)02-0116-05

Specifie cell-Mediated Immune Response in Myasthenia Gravis

GUO Hong ,SUN Hong ,XU xian-hao ,WANG Hong ,ZHANG Hun ,LI Bao-lin(Department of Neurology,Bejing Hospital,the Ministry of Health,Beijing 100730)

　　Abstract：Objective to explore the specific ce11-mediated immune response in the patients with myathenia gravis (MG).Methods IFN-γand IL-4 secreted by peripheral blood mononuclear cells(PBMC)and thymocytes in MG patients and healthy controls were determined with ELISA．IFN-γand iL-4 mRNA were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)after cultured with the stimulation of human nocontinic acetlcholine receptor.The IFN-γ and IL-4expression were monitored in MG patients with Thymectomy(Tx)．Results the expression of IFN-γby PBMC was significartly elevated on all MG pattents，especlally more higher in the acute stage，The transcription of IFN-γand IL-4,IL-4 secretion from thymocytes in MG patients with thymic hyperplasia was high．IL-4 mRNA in thymocytes was well correlated with that in PBMC．IL-4 secretion declined one week after Tx while IFN-γ mRNA decreased one month after tx.Conclusions There was an activation of specific cell-mediated immunity and an imbalance of cytokines from Th1 and TH2 in MG patients．Some of the immune parameters in PBMC might reflect the immun alterations in the thymus from MG panents．The immune mechanism of MG patients with hyperplasia is differnet from that thymoma.Thymectomy followed by treatment with a-drenocorticosteroid is necessary for MG pattents．

　　Keywords：myathenia gravis;IFN-γ;IL-4

　　重症肌无力(MyastheniaGravis,MG)是乙酰胆碱受体抗体(AchRAb)针对神经肌肉接头交触后膜上AChR进行破坏而引起的1种获得性自身免疫疾病，曾一度认为体液免疫异常是MG的唯一致病因素，但近年来越来越多的研究表明细胞免疫也参与了MG的发病过程。象其它自身免疫疾病一样，MG的发源地至今不明，但目前认为胸腺的可能性最大。因为约75%的MG患者伴有胸腺异常，其中85%为胸腺增生，15%为胸腺瘤[1];研究还发现，MG患者增生的胸腺内存在大量AChR特异应答性T、B细胞，且远较外周血为多[2];胸腺细胞可表达IL-2、IL-1、IL-6等细胞因子[3,4]提示MG患者胸腺存在免疫学改变。临床发现胸腺摘除(Tx)后，多数患者病情好转,但Tx并非对所有MG患者均有效,有些伴胸腺瘤患者甚至于Tx后会加重[5]，还有一部分MG患者胸腺病理正常，MG患者的PBMC是否存在细胞免疫的活化，不同病理表现MG患者的胸腺组织细胞免疫活性是否也有差异，外周血相应的免疫参数是否能够反映胸腺的免疫学变化，Tx后PBMC的细胞活性有否变化，弄清这些问题，不仅有利于对MG发源地的进一步认识，而且有利于治疗方案的个体化。根据表达细胞因子的不同，将辅助性T细胞(Th)分为Th1和Th2两个亚类，IFN-γ主要由Th1表达，IL-4主要由Th2表达。本文检测了30例MG患者的PBMC、10例行Tx的MG患者胸腺和外周血单个核细胞在特异性抗原AChR刺激下IFN-γ、IL-4mRNA的表达情况，同时检测了细胞培养上清液中2种细胞因子的蛋白表达情况，并与健康对照组进行比较，试图在分子水平上，从细胞因子角度了解MG患者外周血和胸腺细胞的免疫活性情况。

　　 1材料与方法 1.1研究对象所有进入研究的均为北京医院神经科根据临床表现、新斯的明试验、血清AChRAb测定、肌电图重复电刺激和单纤维肌电图检查确诊的MG患者。取PBMC用于检测者30例，男16例、女14例，年龄13～66(38．2±15．8)岁，病程50d～12(3．1±3．6)年，其中14例为初发3个月或复发1个月以内的患者，根据改良的Osserman分型：Ⅰ、Ⅱa、Ⅰb、Ⅱ和Ⅳ型分别为1、6、16、2和5例。于胸外科行Tx的MG患者10例,男6例，女4例，年龄13～57(38．3±15．9)岁，病程50d～(1．35±1.57)年，Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb、Ⅲ和Ⅳ型分别为0、2、4、3和1例。术前行纵隔CT检查，报告：胸腺增生4例，胸腺瘤2例,正常萎缩3例,另1例未能确定胸腺瘤或增生。Tx后病理证实：2例为胸腺瘤,余8例均为胸腺增生。1例曾用糖皮质类固醇激素治疗，并于术前将激素减量至15mg/d，余9例均未曾用过免疫治疗，10例患者于术后第9d拆线，于第10d进行大剂量糖皮质类固醇激素冲击治疗。

　　 健康对照组：20名外周血取自北京医院职工、学生或患者家属，男、女各10名，年龄25～48(35.2±7．4)岁;4例正常胸腺取自先天性心脏病患者行开胸手术者(阜外医院)，男、女各2例，年龄9～39(24．5±14．3)岁。

　　 1．2实验方法 1.2．1外周血及胸腺单个核细胞的分离及培养：取肝素静脉抗凝血10ml，用淋巴细胞分离液提取单个核细胞；取手术摘除之胸腺，生理盐水冲洗干净后，剪碎，筛网过滤，分散成单个细胞，用淋巴细胞分离液提取单个核细胞；行Tx的MG患者于Tx当日、术后1周、2周及术后1个月分别取静脉抗凝血10ml，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，并于当天进行临床评分。

　　 粗提的人腓肠肌AChR[5],采用“固相抗原法”纯化[7]。将单个核细胞加入到结合有AChR的96孔细胞培养板中，每孔3×105个细胞，在37℃，5％CO2孵育6h后，收集部分细胞，其余继续培养，48h后离心，收集上清液，冻于-80℃备用。1．2．2RT—PCR结合狭缝印迹杂交检测IFN-γ和IL-4的Mrna表达：一步法提取细胞总RNA。于每份RNA中加鸟型逆转录酶(AMV)15U,置42℃水浴1h，得到逆转录产物Cdna，进行PCR扩增。在洁净的Eppendorf管中依次加入MgCl2(25mmol／L)、4种Dntp混合物(2．5mmol／L)、上下游引物(15μmol／L)、cDNA5μl,总体积25μl。95％℃预变性5min，加入1μTaqDNA聚合酶，在热循环仪(PTC-51B，军事医学科学院)上进行PCR反应，条件为：94℃变性30s，72℃延伸45s，退火温度分别为：IFN-γ54.5℃，IL-458℃，β-actin65℃，均为30s。循环35次,72℃延伸10min。反应产物于1．5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　 IFN-γ、IL-4和β-actin的PCR引物寡核苷酸序列的5'和3’端依次为CAGCTCTGCATCGTTTTGGGG和ACTGGGATACTCTTCGACCT;CCCCTCTGTTCTTCCTGCTA和CTCTGGTTGGCTTCCTTCA；GTGGGGCGCCCCAGGCACCA和CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC； 将PCR产物95℃变性后经狭缝加样器点样于硝酸纤维素膜。取出膜，预杂交后,加DIG标记的探针(BoehringerMannheim)杂交，充分洗膜，封闭，加抗DIG抗体反应30min，加入新配制的底物工作液，避光反应1h，用Tris-EDTA终止反应。结果用激光密度扫描仪检测。

　　 1．2．3结果计算：以“相对单位”表示PCR扩增产物的量。Β-actin作为内对照。计算公式如下： 1.3统计学处理使用Excel7．O统计软件，用t检验，相关回归等处理有关资料。　2结果 2．1MG患者PBMC经ACMC刺激后IFN-γmRNA转录和表达见表1。

　　 表1MG患者PBMC中IFN-γmRNA转录和表达 Tab1ExpressionandtranscriptionofIFN-γinPBMC 0．01)，其中10例IFN-γ值高于正常均值±2s(30．2±19．8)，健康对照组只有1例高于此上限。

　　 2．2MG患者PBMC经ACMC经AChR激后IL-4Mrna转录和表达见表2。

　　 表2MG患者PBMC中IL-4Mrna转录和表达 Tab2ExpressionandtranscriptionofIL—4inPBMC *P＜0.05，**P＜0.01，Comparedwithcontrol PDMC与AChR共同孵育后，经RT—PCR结合狭缝印迹杂交，检测30例MG患者IPN-γmRNA转录虽高于对照组，但无显著意义(P＝0．43)。而14例急性期MG患者的IFN-γmRAN转录高于对照组(P＜0．01)。患者组IFN-γ表达量高于健康对照组(P＜0．05),14例急性MG患者更明显(P＜ 表3胸腺细胞和PBMC的IFN-γMrna转录和表达 *P＜0.05，**P＜0．01，Comparedwithcontrol PBMC的IL-4Mrna转录和表达，无论在30例MG患者还是其中14例急性期患者，与对照组比较均无显著差异(P＞0．05)。

　　 2．3胸腺细胞和PBMC的IFN—γMrna转录和表达情况见表3。

　　 10例MG患者胸腺单个核细胞经AChR刺激 Tab3ExpressionandtranscriptionofIFN-γinThymocytesandPBMC *P＜0．05，ComparedwithControl 后，IFN-γmRNA转录及表达虽高于健康对照，但无统计学差异(P＞0．05)，进一步分析其中8例病理报告为增生者,发现胸腺和外周血的单个核细胞IFN-γMrna转录均高于健康对照(P＜0．05)；同时发现外周血细胞培养上清液中IFN-γ的表达也表4胸腺细胞和PBMC的IL-4Mrna转录和表达情况高于健康对照(P＜0.05)。而另2例病理诊断为“胸腺瘤”的MG患者，其胸腺细胞IFN-γmRNA转录和表达与对照组比较无统计学意义。

　　 2．4肭腺细胞和PBMC的IL-4Mrna转录和表达情况见表4。

　　 Tab4ExpressionandtranscriptionofIL-4inthymocvtesandPBMC *P＜0．05,Comparedwithcontrol 10例患者胸腺细胞IL-4Mrna转录及表达均明显高于健康对照组(P＜0.05)。而PBMC则无明显区别。进一步分析发现：胸腺增生者胸腺细胞IL-4mRNA转录明显(P＜0．01)高于健康对照,其表达也明显高于健康对照(P＜0．05)，而胸腺瘤者胸腺细胞的IL-4Mrna转录及表达与健康对照无明显区别(P＞0．05)。

　　 2．5胸腺和周围血相关性 2．5.1IFN-γ：8例胸腺增生者胸腺和外周血单个核细胞IFN-γmRNA的转录和表达相关不密切(γ分别为0．49和0．46，P＞0．05)，无统计学意义。

　　 2．5．2IL—4：8例胸腺增生者胸腺和外周血单个核细胞IL—4Mrna转录明显相关(γ＝0.84，PC＜0．01)。而表达量的相关性不密切(γ＝0．21．P＞0．05)。

　　 2．6动态观察8例胸腺增生者的外周血细胞IFN-γ和IL-4的转录及表达情况见表5。

　　 表5动态随访Tx患者临床评分和PBMC细胞因子的Mrna转录与表达 Tab5ThedynamictrendsofthetranscriptionandexpressionofIFN-γandIL-4 *P＜0.05，**P＜0.001,ComparedwiththatdayOonTx 动态检测两种细胞因子的Mrna转录和表达情况，发现PBMC的IFN-γmRNA转录在术后1月即病情明显好转时减少(P＜0．05),而IFN-γ的表达虽然有所下降,但无明显意义。IL—4Mrna转录在术后1周和1个月时都出现下降，但与术前比较无明显差异，而在术后第1周发现IL-4的表达出现一过性减少，且与术前比较有临床意义(P＜0．05)。

　　 3讨论 3．1MG患者AChR特异性Th1的活化IFN-γ主要由有丝分裂原或特异性抗原刺激活化的CD4-Th1细胞表达，是细胞活化早期产生的1种具有多种免疫调节因子，可以上调淋巴细胞或组织细胞表面的组织相容白细胞抗原Ⅰ类抗原表达，激活巨噬细胞且参与B细胞免疫应答。IFN-γ与IL-2、TNF-a有协调作用,从而增强T、B细胞的活化、增殖，增强细胞与体液免疫应答。

　　 本组30例MG患者，尤其是14例急性期患者的PBMC经AChR刺激后，IFN-γ表达高于对照组,且与其相应Mrna转录一致；胸腺增生者PBMC的IFN-γmRNA转录和表达亦高于健康对照组,且发现随着MG患者病情的好转，其PBMC的IFN-γmRNA转录明显减少，提示MG患者有AChR特异性Th1细胞活化增高，IFN-γ可能作为效应因子参与了MG的发病过程。

　　 3．2MG患者AChR特异性Th2变化IL-4作为Th2细胞的自身活化因子,可以促进B细胞的增殖、产生IgG，被认为是介导体液免疫应答的主要因子之一。本组MG患者PBMC的IL-4表达和Mrna转录均不高，但发现胸腺细胞IL-4Mrna转录和表达均高于健康对照组，尤以胸腺增生者为著，且与其PBMC的IL-4mRNA转录明显相关；动态观察胸腺增生者的PBMC，其IL-4Mrna转录在病情好转时出现下降，但与术前比较无明显差异，而在术后第1周发现IL-4表达出现一过性减少．且与术前比较有统计意义，证明在MG患者增生的胸腺中存在有Th2细胞的活化。

　　 3．3不同胸腺病理者,其临床表现、转归和免疫学变化不同：胸腺是T细胞发育、成熟的场所，在MG发病机制中的重要作用早巳为人们所认识，而且Tx现被认为MG的首选治疗方案[8]，但同时发现不同胸腺病理表现的患者其临床表现和实验室检查均有许多差异，本文结果也支持这一点。

　　 本文行Tx的10例MG患者中8例为胸腺增生者，其抗原特异性单个核细胞IFN-γ和IL-4的Mrna转录和IFN-γ表达均明显高于健康对照，其临床疗效较好。而2例胸腺瘤患者这2种细胞因子Mrna转录均很低。胸腺摘除术后，其临床疗效差，需辅以其它免疫治疗。

　　 3．4MG的发病机制有人推测伴有胸腺瘤的MG与伴胸腺增生的MG发病机制可能不同[7,8]。不仅2者在胸腺内的细胞组成、形态、发病年龄、性别不同，病情转归亦不同[9]。许多胸腺瘤患者于Tx后病情加重[6,10]，而且有些胸腺瘤患者于Tx前未表现有MG症状，仅是因非MG原因检查时发现胸腺瘤，于Tx后出现MG，有人推测胸腺瘤可产生某些抑制性因子[11,12]，抑制了自身免疫现象的发生，而Tx后这种抑制因子消失，故可诱发MG或加重原有的MG。尚有人报道胸腺瘤内有AChR特异性T细胞，但未见B细胞[13]。本实验中2例胸腺瘤患者AChR特异性单个核细胞IFN-γ和IL-4的Mrna转录均很低，可能与胸腺瘤内免疫抑制因素的存在有关，也可能与病例数较少有关。

　　 而胸腺增生的MG患者胸腺内AChR特异性单个核细胞反映其活跃程度的IFN-γ、IL-4mRNA转录增高，动态观察发现Tx后1周，PBMC的IL-4表达出现下降，伴随着临床症状的好转，可能表明增生的胸腺细胞中辅助因素占主导地位。　3．5胸腺和周围血免疫学异常的相关性胸腺是免疫中心器官，MG患者主要病理和免疫学异常可能在胸腺。一般文献报道MG患者的免疫学异常是用周围血检测来了解患者的免疫学状态。但这是否可信，于是我们进行了胸腺和周围血有关免疫学异常的对比检测，以了解此两者间相关性。

　　 本组8例胸腺增生者的胸腺和周围血中的细胞因子间的关系：IL-4mRNA转录明显相关(P＜0．05)；IFN-γmRNA转录及其表达基本相关，但未达统计学上有意义的程度；但IL-4表达无相关性。可能有些参数相关密切，有一些相关不密切，这方面有待进一步深入研究。

　　 3.6Th1和Th2的失衡IPN-γ是由Th1细胞表达产生，IL-4由Tb2细胞产生。IL-4是B细胞生长刺激因子，可以刺激B细胞增殖、活化,转化成浆细胞并表达抗体，从而增强体液免疫。在人类IFN-γ可以增强IL-4的这种功能。本文结果提示：MG患者增生的胸腺内Th1细胞和Th2细胞的免疫活性均增强，且以Tn2为主，IL-4的增高在胸腺细胞和外周血细胞中是有一定的相关性的；而PBMC则以Th1增高为主，MG患者体内存在着细胞因子网络的失衡。

　　 3．7Tx后给予患者糖皮质类固醇激素冲击是必要的动态随访行8例胸腺增生者，于术后第9d拆线，第10d开始给子糖皮质类固醇激素冲击治疗。以往经验发现在MG患者由于胸腺的摘除，AChRAb的骤降，患者的临床症状会在数天内好转，但是由于在二级淋巴器官仍存在有长命T淋巴细胞，故患者旋即出现症状加重，所以临床多予糖皮质类固醇冲击治疗，而患者在冲击的1～10d可能出现加重，本组8例患者在术后1周的临床评分较术前减轻(P＜0．05)，但在2周时有部分患者加重，而术后1个月患者的临床评分明显好于治疗前(P＜0．001)。动态检测2种细胞因子的mRNA转录和表达情况，发现PBMC的IPN-γmRNA转录在术后1月即病情明显好转时减少(P＜0．05)，而IPN-γ的表达也有所下降。IL-4mRNA转录在术后1周和1个月时都出现下降，但与术前比较无明显差异。而在术后第1周发现IL-4的表达出现一过性减少，且与术前比较有临床意义(P

　　 总之，本文从一个角度证明了MG患者外周血和胸腺存在免疫学异常，提示胸腺摘除及辅助以糖皮质类固醇冲击对治疗MG是必要的；外周血免疫参数可基本反映胸腺细胞的免疫活跃程度，可为临床治疗的个体化提供线索，但这方面有待累积更多资料。

　　基金项目：卫生部课题基金资助项目(96-3-101)

　　作者简介：国 红(1962-)．女，山东寿光县人，副主任医师，大学，主要从事神经免疫的研究。参考文献：

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收稿日期：2000-01-04