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人DAO氨基酸序列片段B-细胞表位的多参数预测
免疫学杂志 2000年第3期第16卷 技术与方法
作者：陈兴 王更银 丛爱丽 张立 许素菊
单位：陈兴（白求恩国际和平医院检验科，河北 石家庄 050082）；王更银（白求恩国际和平医院检验科，河北 石家庄 050082）；丛爱丽（白求恩国际和平医院检验科，河北 石家庄 050082）；张立（白求恩国际和平医院检验科，河北 石家庄 050082）；许素菊（白求恩国际和平医院检验科，河北 石家庄 050082）
关键词：二氨氧化酶（DAO）；B-细胞表位；预测
［摘 要］目的 预测人二氨氧化酶（DAO）氨基酸序列片段（aa No.524-618）的B-细胞表位。方法 应用6种参数和方法进行综合分析，包括Hopp ＆ Woods亲水性参数、抗原性参数、可及性参数、β-转角、万氏及吴氏综合预测方法。结果 显示B-细胞识别的表位可能在543-553和569-595残基或其附近，569-595残基4种参数和方法的预测值均高于543-553残基，这两个被预测的表位均含有β-转角和不规则卷曲结构。结论 本研究为应用合成肽抗原制备抗人DAO抗体提供了依据。
［中图分类号］Q51； R393.11 ［文献标识码］A
［文章编号］1000-8861（2000）03-0232-03
The multi-parameter prediction of B-cell epitopes in amino acid sequence fragment of human DAO
CHEN Xing，WANG Geng-yin，CONG Ai-li，ZHANG Li，XU Su-ju
（Department of Clinical Laboratory，the Bethune International Peace Hospital，Shijiazhuang 050082，China）
［Abstract］Objective To predicate B-cell epitops in amino acide sequence （aa.No.524-618） of human diamine oxidase（DAO）.Method Six parameters and methods were used，including Hopp ＆ Woods hydrophility，antigenicity（Welling），accessibility（Janin），β-turns，Wan's method and Wu's method.Results It showed that B-cell epitops were probably at or adjacent to 543-553 and 569-595.The predicted values of 4 parameters and methods of 569-595 was higher than 543-553.All the 2 predicted epitops are rich in β-turns and random coil.Conclusion The finding is helpful for preparation of antibody to human DAO using the synthetic peptide approach.
［Key words］diamine oxidase（DAO）；B-cell epitope；prediction
人二胺氧化酶（DAO，E.C.1.4.3.6）是一种催化二胺（组胺、腐胺和尸胺）氧化的酶。DAO在分裂细胞中高度表达，并已观察到与一些人类肿瘤有关［1，2］。CHASSANDE报道人DAO氨基酸序列由751氨基酸残基组成，分别由其基因序列的五个外显子编码，第一外显子很短，不编码序列，其余四个外显子分别编码氨基酸序列1-523，524-618，619-663和664-751。通过与已知序列比较，揭示其活性位点由第二外显子编码，而其氨基吡咪结合位点在蛋白质的C-末端［2］。本文选取第三外显子编码的氨基酸序列片段（524-618）进行多参数B-细胞抗原表位预测，以克服单参数预测模型的局限性，提高预测的准确性，为合成多肽抗原提供依据，同时对预测结果进行了讨论。
1 材料和方法
1.1 微机及软件 P-133微机（北京 柏安电脑公司）；GOLDKEY核酸和蛋白质分析软件及核酸和蛋白质数据库光盘（北京 军事医学科学院基础医学研究所）。
1.2 人DAO氨基酸序列片段（524-618） 见图1。
图1 人DAO 氨基酸序列片段的氨基酸顺序
Fig1 The amino acid sequence fragment of human DAO
1.3 分析方法
1.3.1 单参数分别预测：首先应用GOLDKEY软件从蛋白质数据库中调出人DAO氨基酸序列，截取上述片段。选取4个主要参数：Hopp ＆ Woods亲水性参数（Hydrophilicity）［3］，Welling抗原性参数（Antigenicity）［4］，可及性参数（Accessibility）［5］和二级结构（the secondary structures）［7］分别进行单参数预测，各参数的意义见引文。
1.3.2 综合预测：应用万涛等报道综合预测方法［7］和吴玉章报道的抗原性指数分析曲线［8］与上述单参数方法对照，以避免编程不同造成的误差。
1.3.3 结果分析：将上述方法互相参照，综合分析比较，兼顾各预测参数推断B细胞识别的表位。
2 结果
2.1 单参数的预测结果 分别见分析曲线图2～图5，图中高于阈值的残基所对应的肽段即为预测的抗原表位。
图2 亲水性参数对DAO序列片段的预测结果
Fig2 The predicted hydrophilicity of DAO amino acid sequence fragment 2.1
图3 抗原性参数对DAO序列片段的预测结果
Fig 3The predicted antigenicity of DAO amino acid sequence fragment
图4 可及性参数对DAO序列片段的预测结果
Fig4 The predicted accessibility of DAO amino acid sequence fragment
图5 DAO序列片段二级结构的预测结果
Fig 5The predicted secondary structures of DAO amino acid sequence fragment
2.2 多参数预测结果 应用万氏法的预测结果（见图6），吴氏法的预测结果（见图7）。
图6 万氏法对DAO序列片段抗原表位的预测结果
Fig6 The predicted epitope of DAO amino acid sequence using Wan’s method
图7 吴氏法对DAO序列片段抗原表位的预测结果
Fig7 The predicted epitope of DAO amino acid sequence using Wu’s method
2.3 综合分析比较 将各种参数和方法预测的可能有抗原表位的肽段列于表1。从表中可以发现应用不同的预测方法，其预测的抗原表位的个数和抗原表位可能出现的肽段有所不同，但氨基酸序列片段543-553和569-595则显示多种预测方法基本一致，有较好的亲水性和可及性，在二级结构上则含有易形成抗原表位的不规则卷曲和β-转角结构［9］。因此B-细胞表位可能在这些片段或它们附近。为制备抗DAO抗体，我们根据上述分析结果选取氨基酸残基567-582片段作为抗原肽合成片段，其含有16个氨基酸残基（顺序为FRFKRKLPKYLLFTSP）此片段多种预测方法皆显示其有抗原表位，且接近β-转角处。
表1 应用不同方法预测人DAO B-细胞表位的肽段位置
Tab1 The position of the predicted B-cell epitope of human DAO by different methods
| Prediction Methods |
Predicted epitopes |
| Hydrophilicity | 524-529，534-541，544-551，553-559，
560-566，568-575，581-595，600-603 |
| Antigenicity | 524-526，528-530，543-552，561-579，
586-597，600-602，603-605 |
| Accessibility | 525-550，553-575，580-596，607-615 |
| Secondary structure（β-turn） | 527，545，584，585，589，561 |
| Wan’s method | 527-529，542-546，554-562，569-574，
582-585，590-594-，609-611 |
| Wu’s method | 539-553，573-578，584-586，594-596，605-618 |
3 讨论
蛋白质抗原表位的预测工作对于分子生物学实验，如多肽疫苗的合成，诊断试剂的制备和单克隆抗体的筛选等，都是必不可少的工具，并且得到越来越广泛的应用［10］。已有多种单参数预测模型和相应的分析软件在蛋白质抗原决定簇预测中应用，均有成功预测的报道。本研究采用GOLDKEY核酸和蛋白质分析软件是大型综合分析软件，其具有的多种蛋白质物化性质指标分析和比较功能以及与之配套的蛋白质光盘数据库为人DAO氨基酸序列片段B-细胞表位的多参数分析预测提供了可能。
单参数预测有其局限性，因为亲水性和可及性是形成表位的首要条件，但其并不能表示其一定具有抗原性。表位的形成还与序列中特定氨基酸的出现、片段的活动性及二级结构的构象有关。万涛等依据上述重要的预测参数，依照其权重的不同，建立多参数综合预测模型。吴玉章等建立的预测方法则综合考虑了蛋白质的许多性质如片段的活动性、结构、构象和氨基酸侧链的排列等。虽其是针对病毒蛋白表位预测而设计，但对普通蛋白的预测亦有重要的参考价值。我们采用多参数和多方法的综合预测可提高预测的准确性。从结果分析中可以看出依据不同的预测方法，其预测的抗原表位的数目和所处的肽段位置有所不同，但在氨基酸序列片段543-553和569-595这两个肽段几种预测方法的结果基本一致，因此我们认为此两处或其附近可能具有抗原表位。而后者的抗原性可能强于前者，因后者亲水性、抗原性、可及性和万氏法预测指数（分别为1.7，0.1，4.86，5.85）均高于后者（0.72，0.05，7.31，1.74）当然其结果尚需通过实验证实。依据上述分析结果，我们合成567-582片段（含16个氨基酸残基）的多肽抗原，成功制备了其多克隆和单克隆抗体，应用ELISA间接法检测其抗体可与天然DAO（Sigma产品）反应。实验证实了其预测的正确性（结果我们将另文发表）。本文的预测结果亦为开展人DAO的免疫学研究提供了线索。
（本文工作蒙第三军医大学免疫研究所教授吴玉章博士和军事医学科学院国家生物医学分析中心生物医学信息计算机分析实验室吴家金主任指导，特此致谢。）
［基金项目］北京军区“九五”课题资助项目（95B019）
［作者简介］陈兴（1954-），男，天津宝坻县人，副主任技师，大学，主要从事蛋白质纯化、抗体制备及其临床免疫检验方面的研究。
［参考文献］
［1］WOLVEKAMO MC，DE RRUIN RW.Diamine oxi-dase：an overview of historical，biochemical and function［J］.Dig Dis，1994，12（1）：2～14.
［2］CHASSANDE O，RENARD S，BARBRY P，et al.The human gene for diamine oxidase，an amiloride binding proteinmolecular cloning，sequencing，and characterization of the promoter［J］. J Bio Chem，1994，269（20）：14884～14889.
［3］HOPP TP，WOODS KR．Prediction of protein anti-genic determinants from amino acid sequences［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1981，78：3824～3828．
［4］WELLING GW，WEIJER WJ，VAN DER ZEE R，et al.Prodiction of sequential antigenic regions in proteins［J］.FEBS Lett，1985，188：215～218.
［5］JANJIN J.Surface and inside volumes in globular proteins［J］.Nature（London），1979，277：491～492.
［6］CHOU PY，FASMAN GD.Prediction of the secondary structure of proteins from amino acid sequence［J］．Adv Enzymol，1978，178：586～589.
［7］万涛，孙涛，吴家金.蛋白顺序性抗原决定簇的多参数综合预测［J］.中国免疫学杂志，1997，13（6）：329～333.
［8］WU YUZHANG，ZHU XIHAU.A new approach for B-cell epitope prediction in viral proteins［J］.Chinese Science Bulletin，1995，40（9）：761～763.
［9］KRCHNAK V，MACH O，MALY A.Computer pre-diction of B-cell determinants from protein aminoacid sequences bacd on incidence of β-turns［J］.Methods in Enzymology，1989，178：586～611.
［收稿日期］1999-09-06；［修回日期］1999-11-19