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ROS对小鼠腹腔巨噬细胞凋亡的影响
免疫学杂志 2000年第5期第16卷 基础免疫学
作者：黄行许 陈练波 马晓冬 乔东访 鲍永耀 朴英杰
单位：黄行许（第一军医大学中心实验室，广东 广州 510515）；陈练波（第一军医大学中心实验室，广东 广州 510515）；马晓冬（第一军医大学中心实验室，广东 广州 510515）；乔东访（第一军医大学中心实验室，广东 广州 510515）；鲍永耀（第一军医大学中心实验室，广东 广州 510515）；朴英杰（第一军医大学中心实验室，广东 广州 510515）
关键词：ROS；凋亡；凋亡调控；巨噬细胞；激光扫描共聚焦显微镜
［摘 要］ 目的 探讨ROS影响巨噬细胞凋亡的机制。方法 激光扫描共聚焦显微术、流式细胞术和荧光标记技术等。结果 ①凋亡巨噬细胞内NADPH氧化酶活性急剧降低使得胞内ROS水平快速下降；②ROS清除剂促进地塞米松诱导的巨噬细胞凋亡；③PKC促进巨噬细胞凋亡和ROS急剧减少；cAMP抑制巨噬细胞凋亡和ROS急剧减少。结论 ①ROS抑制地塞米松诱导的巨噬细胞凋亡；②PKC、cAMP等因素通过影响地塞米松介导巨噬细胞凋亡时发生的ROS变化促进或抑制巨噬细胞凋亡。由此可见，ROS作为一种巨噬细胞的信使分子和效应分子，一方面抑制巨噬细胞自身凋亡，一方面执行巨噬细胞介导其它细胞凋亡的作用。
［中图分类号］ Q28 ［文献标识码］ A
［文章编号］1000-8861（2000）05-0334-05
Effects of ROS on apoptosis in murine peritoneal macrophage
HUANG Xing-xu，CHEN Lian-bo，MA Xiao-dong，QIAO Dong-fang，BAO Yong-yao，PIAO Ying-jie
（Central Laboratory，the First Military Medical University，Guangzhou 510515，China）
［Abstract］ Objective To study the mechanisms of ROS affecting apoptosis in murine peritoneal macrophages． Methods Laser scanning confocal microscopy，flow cytometry and fluorescence labeling were used．Results ①The activity of NADPH oxidase in apoptotic macrophages declined sharply，which resulted in rapid decrease of ROS；②ROS scavengers promoted dexamethasone induced apoptosis of macrophages；③PKC promoted，and cAMP inhibited the apoptosis of macrophages and the rapid drop in ROS．Conclusions ①ROS inhibits dexamethasone induced apoptosis of macrophage；②PKC、cAMP regulate the process of apoptosis of macrophage by promoting or inhibiting changes of ROS in apoptotic macrophages． These results proved that，ROS，act both as a signal molecule and an effector of macrophages，inhibits apoptosis in themselves and mediates apoptosis in other cells．
［Key words］ ROS；apoptosis；apoptosis regulation；peritoneal macrophage；LSCM
巨噬细胞受到刺激或进行吞噬作用后，发生呼吸爆发，产生大量ROS（活性氧），并通过ROS杀灭和吞噬微生物［1］。ROS作为细胞凋亡的介导者［2］，又是巨噬细胞在肿瘤免疫中发挥独特作用的基础。激活的巨噬细胞生成ROS、TNF-α（肿瘤坏死因子）等，通过诱导细胞凋亡的方式杀灭肿瘤细胞［3］。由此可见，ROS是巨噬细胞实现其正常功能的主要工具之一。现在发现，机体还必须通过调控巨噬细胞自身凋亡保持巨噬细胞数量恒定［4］。本实验利用激光扫描共聚焦显微镜可原位、实时观察活细胞变化的特点，追踪大剂量地塞米松处理诱发巨噬细胞快速凋亡过程中胞内ROS的动态变化，检测PKC、TPK、cAMP、cGMP等信使分子对巨噬细胞凋亡和ROS变化的影响，初步探讨ROS在巨噬细胞介导肿瘤细胞［3］和其它细胞［5］凋亡过程中调控巨噬细胞自身凋亡的机理。
1 材料和方法
1．1 实验材料
1．1．1 实验动物：18～20 g雌性昆明小鼠。
1．1．2 实验试剂：碘化丙啶（propidium iodide，PI）、巯基乙醇酸钠（thioglycolate）、HEPES（N-［2-Hydroxyethyl］、piperazine-N'-［2-ethanesulfonic acid］）、staurosporine、genistein、DcAMP（dibytyryl cyclic 3’5’-adenosine monophosphate，双丁酰环腺甘酸）、亚甲蓝（methylene blue）、过氧化物酶（catalase）、DMSO（dimethyl sulfone，二甲亚砜）购自美国Sigma公司；2'，7'-二氯荧光素二脂（2'，7'-dichlorofluorescin-diacetate，DCFH-DA）、HE（hydroethidine），购自美国Molecular Probes公司；TUNEL试剂盒、核糖核酸酶（RNase）、蛋白酶K（proteinase K），购自德国Boehringer Mannheim公司；RPMI-1640，购自德国GIBCO BRL 公司；小牛血清，购自杭州四季青生物材料厂。其它试剂均为国产分析纯。
1．2 实验方法
1．2．1 细胞培养：18～20 g雌性昆明小鼠，按1次／d，1 ml／次连续3 d腹腔注射1％巯基乙醇酸钠，停1 d，常规方法取腹腔巨噬细胞（台酚兰吞噬实验显示99％为巨噬细胞），以1×106个／ml接种于96孔细胞培养板（Nunc，丹麦）和改装35 mm Petri皿（Meridian，美国）上，用含10％小牛血清的RPMI-1640培养于37 °C，含5％ CO2孵箱（Quene System，美国）内。12 h后加入大剂量地塞米松（1×10－4 mol／L）处理细胞。
1．2．2 细胞凋亡检测
1．2．2．1 流式细胞术：按上述条件培养、处理的巨噬细胞，按每个样品1×106个，用细胞刮（rubber policeman）从培养板上刮下，离心收集。按常规方法制样，PI染色，Elite流式细胞仪（COULTER，美国）采集数据（激发光波长488 nm，发射光波长633 nm），并用Multicycle分析软件分析，通过计数凋亡区（亚二倍体区）细胞数量得出凋亡率。
1．2．2．2 TUNEL染色：按GAVRIELI等人的方法进行［6］。
1．2．2．3 DNA琼脂糖电泳：按MEBMER等人的方法进行［7］。
1．2．3 ROS检测：按黄行许报道呼吸爆发检测方法［8］，细胞用ROS特异性荧光探针DCFH-DA标记，在激光扫描共聚焦显微镜（Meridian，美国）上用检测器1（激发波长：488 nm；发射波长：530 nm）检测得到反映细胞内ROS水平的规一化DCF荧光变化曲线图。
1．2．4 NADPH氧化酶活性检测：按ROS检测方法进行，细胞用超氧离子特异性荧光探针HE标记后，在ACAS570激光扫描共聚焦显微镜上用检测器1检测得到反映细胞内超氧离子水平的规一化EB荧光强度变化曲线。
2 结果
2．1 凋亡检测结果
2．1．1 出现特异性凋亡峰：流式细胞分析术分析显示，地塞米松处理巨噬细胞出现特征性的凋亡峰，计数特征性凋亡峰内的细胞数得出细胞凋亡率。统计分析结果表明：经地塞米松处理0、0.5、1．0、2．0、4．0和8．0 h巨噬细胞的凋亡率（％）分别为：0、18．0、25．5、36．3、56．4和76．1。
2．1．2 DNA降解：DNA琼脂糖电泳结果如图1所示，大剂量地塞米松处理巨噬细胞0.5 h即可见到少量DNA条带，处理1．0 h后条带增多，呈现典型的梯状。随后，处理时间越长，梯状条带越明显。
图1地塞米松诱发巨噬细胞DNA梯状条带
Fig 1Dexamethasone induced a DNA ladder in
macrophages
The mouse peritoneal macrophages were incubated with 1×10－4 mol／L dexamethasone（cont：control；mark：marker）． DNA fragmentation was visualized on agarose gel electrophoresis．
2．1．3 TUNEL染色阳性：TUNEL检测地塞米松处理4．0 h巨噬细胞，几乎所有细胞均为TUNEL阳性（见图2），对照细胞呈TUNEL阴性。
2．2 ROS生成变化 脂溶性DCFH-DA进入细胞后，被脂酶水解成DCFH，不发荧光的DCFH再被细胞内的ROS氧化成发荧光的DCF［10］，用激光扫描共聚焦显微镜检测DCF的荧光强度显示出细胞内的ROS水平。ROS水平变化也反映细胞的呼吸爆发水平改变。地塞米松处理使巨噬细胞内的荧光强度急剧下降，加样后的100 s内，荧光强度下降到0.3，下降速度为7．0×10－3／s，随后的160 s内荧光强度以1．125×10－3／s下降至0.18，进入平台（见图3）。
图2巨噬细胞TUNEL染色，×200
Fig 2TUNEL evidence for apoptosis in macrophages
The mouse peritoneal macrophages were incubated with 1×10-4 mol／L dexamethasone for 4 h，then fixed and observed microscopically by TUNEL staining，×200
图3地塞米松（1×10-4mol／L）处理巨噬细胞DCF荧光变化曲线图
Fig 3Fluorescence variation curve for DCF in macrophages treated with dexamethasone（1×10－4 mol／L）
Axis Y and X indicated normalized fluorescence and time respectively． The graph is representative of three similar experiments．
2．3 NADPH氧化酶活性变化 细胞呼吸爆发时，NADPH（nicotinomide adenine dinucleotide phosphate）氧化酶直接催化氧分子生成超氧离子，超氧离子歧化生成过氧化物和超氧化物等ROS。超氧离子不能氧化DCFH-DA，但可氧化不发荧光的HE成发荧光的溴化乙啶（ethidium bromide，EB）［9］；使用激光扫描共聚焦显微镜检测细胞内溴化乙啶的荧光强度可反映NADPH氧化酶活性。如图4所示，地塞米松处理，使胞内荧光强度急剧下降。
图4地塞米松（1×10－4 mol／L）处理巨噬细胞EB荧光变化曲线图
Fig 4Fluorescence variation curve for EB in macrophages treated with dexamethasone（1×10－4 mol／L）
Axis Y and X indicated normalized fluorescence and time respectively． The graph is representative of three similar experiments．
2．4 信使分子的影响
2．4．1 信使分子对巨噬细胞凋亡的影响：利用流式细胞术检测了不同处理对大剂量地塞米松（1×10－4 mol／L）诱导巨噬细胞凋亡的影响，结果如图5所示。
图5信使分子对地塞米松介导巨噬细胞凋亡的影响
Fig 5The effect of signal molecules on macrophage apoptosis induced with dexamethasone
The macrophages were precultured with：1．control；2．staurosporine（5×10－8 mol／L）；3．DcAMP（1×10－4 mol／L）；4．methylene blue（1×10－4 mol／L）；5．genistein（50 μg／ml）;6．DMSO（1．0％） and catalase（5×103 U／ml）．All the data represent means of three independent experiments．
2．4．2 信使分子对凋亡巨噬细胞ROS变化的影响：激光扫描共聚焦显微镜检测不同处理对地塞米松引起的DCF荧光强度变化的影响。结果显示：staurosporine（5×10－8 mol／L）处理，荧光强度降低到0.9后缓慢升高到起始水平，再缓慢降低到0.3（见图6-a）；DcAMP（1×10－4 mol／L）处理，荧光强度逐渐升高25％（见图6-b）；亚甲蓝（1×10－4 mol／L）和genistein（50 μg／ml）处理，不影响荧光强度变化。staurosporine、DcAMP、亚甲蓝和genistein单独处理，DCF荧光强度稳定。
图6地塞米松（1×10－4mol／L）处理巨噬细胞DCF荧光变化曲线图
Fig 6Fluorescence variation curve for DCF in macrophages treated with dexamethasone（1×10－4 mol／L）
Axis Y and X indicated normalized fluorescence and time respectively． The cells were precultured with staurosporine（5×10－8 mol／L）．（a）：DcAMP（1×10－4 mol／L）；（b）：Both the above graphs are representative of three similar experiments．
3 讨论
小剂量（1×10－6 mol／L）地塞米松处理18 h可引起小鼠腹腔巨噬细胞凋亡［10］。本实验结果显示：大剂量（1×10－4 mol／L）地塞米松处理0.5 h DNA开始分解，出现少量条带，1．0 h后条带呈典型的梯状。地塞米松处理4．0 h，巨噬细胞几乎全部表现为TUNEL阳性，随着地塞米松处理时间延长，凋亡峰越明显。表明大剂量地塞米松介导小鼠腹腔巨噬细胞快速凋亡。
凋亡时细胞内ROS或减少［11］或增多［2］。王广庆报道了地塞米松抑制巨噬细胞产生氧自由基的现象［12］。但地塞米松诱导巨噬细胞凋亡过程中ROS的变化仍不清楚。检测发现，地塞米松处理巨噬细胞内的DCF荧光强度在0.5 h内快速下降到最低水平，表明巨噬细胞内的ROS迅速减少。由于巨噬细胞的ROS主要由呼吸爆发作用生成，凋亡巨噬细胞内的ROS迅速减少表明凋亡巨噬细胞呼吸爆发作用急剧减弱。
通常，凋亡因子作用可引起线粒体膜电位降低，使线粒体电子传递和ATP合成解偶联，导致ROS生成增多。凋亡巨噬细胞为何未发生ROS生成增多呢？王广庆等认为，大剂量地塞米松抑制巨噬细胞产生ROS可能与大剂量地塞米松激活低亲和力糖皮质激素受体相关［12］。进一步检测NADP氧化酶活性发现，地塞米松使巨噬细胞内HE荧光强度急剧下降，显示细胞内的超氧离子水平急剧降低，表明NADP氧化酶的活性快速丧失。NADP氧化酶是巨噬细胞发生呼吸爆发生成ROS的功能酶，因而，正是其活性快速下降使凋亡巨噬细胞的呼吸爆发水平快速下降，细胞内的ROS快速减少。NADP氧化酶活性降低可能与凋亡巨噬细胞胞浆酸化相关，NADP氧化酶最适pH为6．8～7．8，胞浆pH降低抑制细胞的呼吸爆发，ROS生成减少。
ROS既促进细胞凋亡［2］，又抑制细胞凋亡［13］。本实验结果显示：加入ROS清除剂过氧化物酶和DMSO处理，地塞米松诱发的巨噬细胞凋亡率升高为43．8％，增加幅度为21％。表明ROS抑制地塞米松介导的巨噬细胞凋亡。
细胞凋亡受多种信号途径调控。本实验结果显示：不同信使分子影响巨噬细胞凋亡以及凋亡巨噬细胞内ROS生成变化。
PKC是一大类丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，在许多重要的细胞生物学过程中起调控作用。PKC促进或抑制细胞凋亡。PKC对巨噬细胞凋亡的调控也是双向的［4，7］。检测结果显示：PKC抑制剂staurosporine使地塞米松诱导的巨噬细胞凋亡率下降了36．2％，表明PKC促进地塞米松介导的巨噬细胞凋亡。经staurosporine处理，地塞米松使DCF荧光强度缓慢降低，表明PKC促进ROS急剧减少。
正常情况下，cAMP激活cAMP依赖性蛋白激酶使其靶蛋白上某些丝氨酸和苏氨酸磷酸化，从而影响这些蛋白的生物学功能。一方面，cAMP可通过使胞浆游离Ca2+升高，或通过增强糖皮质激素受体的功能促进细胞凋亡［14］；另一方面，cAMP又可抑制T细胞受体激活介导的T细胞杂交瘤细胞凋亡［15］。经DcAMP处理，地塞米松使DCF荧光强度不降反升。表明cAMP抑制地塞米松引起的ROS降低。
亚甲蓝是鸟甘酸环化酶的抑制剂，通过减少细胞内cGMP的生成而抑制cGMP的生物学功能。MEBMER报道，cGMP不影响NO介导的巨噬细胞凋亡［9］。本实验结果显示：亚甲蓝处理后，地塞米松介导的巨噬细胞凋亡率下降了10.8％。TPK信号转导通路可促进细胞凋亡，或抑制细胞凋亡。用TPK抑制剂genistein处理，地塞米松介导的巨噬细胞凋亡率下降了6．6％，表明了cGMP和TPK对地塞米松介导的巨噬细胞凋亡影响较小。结果还显示，亚甲蓝和genistein处理，不影响DCF荧光强度变化，也就是cGMP和TPK不影响凋亡巨噬细胞内ROS的变化。
检测结果表明：staurosporine和cAMP不但可抑制地塞米松引起的巨噬细胞ROS生成减少，也可抑制地塞米松所诱导的巨噬细胞凋亡；对地塞米松处理巨噬细胞生成ROS影响小的亚甲蓝和genistein对地塞米松介导巨噬细胞凋亡率影响也小，而且使ROS水平升高的cAMP抑制凋亡的幅度大于仅抑制ROS减少的staurosporine。这一结果进一步肯定了ROS抑制地塞米松诱导的巨噬细胞凋亡。
但是，ROS 清除剂过氧化物酶和DMSO处理，地塞米松诱发的巨噬细胞凋亡只有部分被抑制，而且不影响凋亡巨噬细胞内的ROS变化的cGMP和TPK尽管作用很小，还是部分抑制了巨噬细胞凋亡，提示ROS也只是部分抑制地塞米松介导的巨噬细胞凋亡。
综上所述，地塞米松处理巨噬细胞时，NADPH氧化酶活性急剧下降，使得细胞内的ROS快速减少，从而减轻了ROS的凋亡抑制作用，巨噬细胞快速发生凋亡，表明ROS作为一种巨噬细胞的信使分子和效应分子，一方面抑制巨噬细胞自身凋亡，另一方面执行巨噬细胞介导其它细胞凋亡的作用。这一结果为巨噬细胞执行肿瘤免疫时介导肿瘤细胞凋亡，抑制自身凋亡这种独特作用提供了基础，据此我们推测，ROS可能是巨噬细胞实现其独特凋亡调控的复杂调控系统的主要成员之一。
［基金项目］国家自然科学基金资助项目（39870382）；广东省自然科学基金资助项目（980206）
［作者简介］黄行许（1965－），男，江西吉安市人，博士，主要从事细胞凋亡的研究。
［参考文献］
［1］ MALECH HL，GALLIN JI． Current concepts：Immunology， Neutrophils in human diseases ［J］． N Engl J Med，1987，317（4）：687－694．
［2］ WATSON RWG，REDMOND HP，WANG JH，et al． Mechanisms involved in sodium arsenite-induced apoptosis of human neutrophils ［J］． J Leukoc Biol，1996，60（5）：625－632．
［3］ ALIPRANTIS AO，DIEZ-ROUX G，MULDER LCF，et al． Do macrophages kill through apoptosis ?［J］． Immunol Today，1996，17（12）：573－576．
［4］ MUNN DH，BEAL AC，SONG D，et al． Activation-induced apoptosis：developmental regulation of a novel cell death pathway by macrophage colony-stimulating factor and interferon gamma ［J］． J Exp Med，1995，181（1）：127－136．
［5］ DIEZ-ROUX G，LANG RA． Macrophages induce apoptosis in normal cells in vivo ［J］． Develop，1997，124（18）：3 633－3 638．
［6］ GAVRIELI Y，SHERMAN Y，SHMUEL A． Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation［J］． J Cell Biol，1992，119（3）：493－502．
［7］ MEBMER UK，LAPETINA EG，BRUNE B． Nitric oxide-induced apoptosis in RAW 264．7 macrophages is antagonized by protein kinase C- and protein kinase A-activating compounds ［J］． Mol Pharmocol，1995，47（4）：757－765．
［8］ 黄行许，鲍永耀，黄 辉，等．利用共焦镜检测巨噬细胞呼吸爆发［J］．免疫学杂志，1998，14（2）：101－103．
［9］ ROTHE G，VALET G． Measurement of NADP oxidase activity with hydroethidine ［A］． In：ROBINSON JP，ed． Handbook of flow cytometry methods ［M］． Wiley-Liss，Inc，1993．159－160.
［10］ 黄行许，朴英杰，鲍永耀，等．共聚焦镜观察凋亡巨噬细胞内pH的变化 ［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，1999，8（1）：37－39．
［11］ WANG GF，JERRLLS TR，SPITZER JJ． Decreased production of reactive oxygen intermediates is an early event during in vitro apoptosis of rat thymocytes ［J］． Free Radic Biol Med，1996，20（4）：533－542．
［12］ 王广庆，胡复荪，安长荣，等．地塞米松抑制巨噬细胞产生氧自由基和一氧化氮［J］．中国药理学通报，1995，11（5）：406－408．
［13］ BRUNE B，GOTZ C，MESSMER UK，et al． Super-oxide formation and macrophage resistance to nitric oxide-mediated apoptosis［J］． J Biol Chem，1997，272（11）：7 253－7 258．
［14］ AHARONI D，DANTES A，OREN M，et al． cAMP-mediated signals as determinants for apoptosis in primary granulosa cells ［J］． Exp Cell Res，1995，218（1）：271－282．
［15］ LEE MR，LIOU ML，YANG YF，et al． cAMP analogs prevent activation induced apoptosis of T cell hybridomas ［J］． J Immunol，1993，151（10）：5 208－5 217．
［收稿日期］2000-03-13； ［修回日期］ 2000-06-05