ANAE染色和抗Thy1-SPA菌体花环双标记法的建立及其用于检测小鼠T淋巴细胞的研究

ANAE染色和抗Thy1-SPA菌体花环双标记法的建立及其用于检测小鼠T淋巴细胞的研究

免疫学杂志 2000年第5期第16卷 技术与方法

作者：骆云鹏　范维珂　段积华　李培然　骆询

单位：骆云鹏（重庆医科大学病理生理学教研室，重庆 400016）；范维珂（重庆医科大学病理生理学教研室，重庆 400016）；段积华（重庆医科大学病理生理学教研室，重庆 400016）；李培然（重庆医科大学病理生理学教研室，重庆 400016）；骆询（College of Arts and Sciences，Suffolk University，Boston，MA 02108 USA）

关键词：小鼠T淋巴细胞；ANAE-抗Thy1SPA菌体花环法；ANAE染色；抗Thy1SPA菌体花环测定法

　　［摘　要］　目的　建立ANAE染色联合抗Thy1SPA菌体花环双标记法，并试图利用此法证明抗θ抗体对ANAE阳性淋巴细胞的特异作用。方法　利用双标记法对正常小鼠胸腺及脾细胞进行检测，观察抗Thy1SPA抗体对ANAE阳性细胞结合的专一性。结果　双标记法中，抗Thy1SPA菌体花环阳性同ANAE阳性一样，能很好反映615小鼠胸腺或脾脏T细胞数（P＞0.05）；胸腺和脾脏细胞Thy1⁺-ANAE⁺率，即双标记阳性率略低于总的ANAE⁺或总抗θ菌体花环⁺数，但3者之间有明显的相关性。结论　成功建立了ANAE-抗Thy1SPA菌体花环法，并首次用此法证明抗θ血清对ANAE阳性细胞的特异作用。

　　［中图分类号］　R392．33　　　［文献标识码］　A

　　［文章编号］1000-8861（2000）05-373-04

Mouse T lymphocytes determined by ANAE assay combined with anti-Thy1-SPA rosette technique

LUO Yun-peng　FAN Wei-ke　DUAN Ji-hua　LI Pei-ran

　　（Department of Pathophysiology，Chongqing University of Medical Sciences，Chongqing 400016，China）

　　LUO Xun

　　（College of Arts and Sciences，Suffolk University，Boston，MA 02108 USA）

　　［Abstract］　Objective　To demonstrate the anti　θ serum directly and its specific action on ANAE positive T lymphocytes，and to develop a ANAE assay combined with anti-Thy1SPA rosette technique．Methods　The anti-mouse Thy1（θ antigen）antibodies were utilized to determine T lymphocytes in the thymus and spleen of healthy mice by ANAE-anti-Thy1SPA rosette technique． Results　The total ANAE⁺，total Thy1⁺，ANAE⁺-Thy1⁺ detected by the ANAE-anti-Thy1SPA technique，were 95．46％±2．40％，93．46％±4．19％ and 91．27％±5．52％ in thymus cells and 45．85％±4．40％，47．50％±4．33％ and 41.45％±3．97％ in spleen cells respectively．These results show that correlation of the two methods is good，although ANAE⁺-Thy1^－and ANAE^－_Thy1⁺ lymphocyte subsets exist in this technique． Conclusions　The ANAE-anti－Thy1　SPA technique was successfully developed，and should be further studied in the field of T lymphocyte subsets．

　　［Key words］　mouse T lymphocyte；ANAE-anti-Thy1SPA rosette；　ANAE assay；anti-Thy1 SPA rosette technique

　　迄今对T细胞发育分化的研究，主要在小鼠体内进行，并由此推论至人类。小鼠体内存在着T和B两大类淋巴细胞，并各具有独特的抗原和受体。Thy抗原［ Thy（θ）antigen ］是T淋巴细胞表面特异标志，系由第9对染色体等位基因编码的抗原分子^{［1～5，8～10］}；常用抗Thy 1抗体或兔（异种）抗鼠脑血清籍补体依赖性细胞毒试验加以检测。后来，许多学者又采用上述血清标记含SPA菌体作指示物，直接检测T淋巴细胞表面抗原。MUELLER等则采用ANAE组化法，发现ICR小鼠肠系膜淋巴结副皮质区中94％淋巴细胞ANAE阳性，滤泡内仅7％阳性，而且抗Thy1血清可破坏ANAE阳性淋巴细胞，却不破坏ANAE阴性细胞。故提出淋巴细胞ANAE活性可作为区分T、非T淋巴细胞的标志^［1，4］。

　　作者设想，小鼠ANAE阳性淋巴细胞可能正是或大多是携有Thy1表面标志物的淋巴细胞，应该是可以直接获得证明的。ANAE阳性淋巴细胞能吸附抗Thy1血清标记的含SPA菌体；反之，吸附有抗Thy1血清标记的含SPA菌体的淋巴细胞，胞浆内可能有明显的ANAE活性。因此，本文进行了小鼠淋巴细胞抗Thy1SPA菌体花环与ANAE染色双标记的实验研究，现将结果报告如下。

　　1　材料和方法

　　1．1　实验动物　每次试验选用健康成年615小鼠10只，雌雄各半，体重18～22 g。

　　1．2　材料　冻干含SPA的COWAN Ⅰ菌株和WOOD 46菌株、抗Thy1抗体或兔（异种）抗鼠脑血清（均由卫生部上海生物制品研究所提供）。六偶氮副品红溶液（取副品红1 g溶于25 ml 2 mol／L HCL中，水浴加温助溶，冷却后过滤，4 °C避光保存。临用前称取NaNO₂ 48 mg，溶于1．2 ml双蒸水，加副品红溶液1．2 ml，振匀备用。）孵育液（取0.067 mol／L KH₂PO₄ 40 ml，用0.067 mol／L Na₂HPO₄调节pH至5．0，加入六偶氮副品红溶液2．4 ml，用2 mol／L NaOH调pH至6．0，再加入溶于0.8 ml丙酮的α-乙酸萘酯10 mg，混匀），甲醛-丙酮固定液，1％甲基绿和0.5％锥蓝染液。

　　1．3　小鼠淋巴细胞ANAE染色及抗Thy1-SPA菌体花环双标记法的建立

　　1．3．1　细胞制备：常规制备胸腺、脾细胞悬液，调整浓度至2×10⁷个／ml。

　　1．3．2　标记SPA菌体之制备：取10％SPA菌液1 ml于离心管内，用PBS洗涤3次，1 000 r／min离心5 min，去上清后加入1∶40稀释的抗Thy1血清100 μl，混匀。37 °C保温30 min后，PBS洗涤2次，恢复原体积，加入1‰　NaN₃ 100 μl备用。

　　1．3．3　ANAE染色及抗Thy1SPA菌体花环双标记：取0.1 ml细胞悬液，加抗Thy1SPA菌试剂0.05 ml，37 °C下保温15 min，PBS洗3次，冷甲醛-丙酮固定液固定，将细胞悬液涂片、风干，行ANAE染色，即将涂片放入孵育液中孵育3 h，（pH6．0，温度37 °C），水洗后1％甲基绿染色20 min，水洗后脱水并DPX封固，油镜下检查200个淋巴细胞，淋巴细胞表面结合10个以上SPA菌体者为Thy1阳性，胞浆内有红棕色颗粒者为ANAE阳性，分别算出胸腺和脾细胞双标记阳性、单SPA细菌花环阳性、单ANAE阳性及双标记阴性细胞的百分率。

　　1．4　干扰实验

　　1．4．1　COWANⅠ菌株同WOOD 46菌株试剂的对比：采用含SPA菌体COWANⅠ株和不含SPA的WOOD 46株，分别用抗Thy1抗体标记，对同一小鼠胸腺和脾细胞进行检测。

　　1．4．2　抗鼠αFP血清同抗鼠Thy1抗体标记菌体的对比：取胸腺和脾细胞悬液，分别用抗Thy1血清和抗αFP血清标记的SPA菌体，同前法实验、检测。

　　2　结　果

　　2．1　ANAE染色及抗Thy1-SPA菌体花环双标记法检测T细胞之形态特征　菌体花环阳性细胞表面之细菌无色或呈翠绿色（绿色调系甲基绿复染所致），有折光性；ANAE染色阳性淋巴细胞则于胞浆内出现红棕色颗粒，呈单个斑点状或多颗粒状；双标记阳性细胞则兼有上述两种特征。另一类为“非T细胞”，其中“B细胞”细胞形态小，ANAE染色和SPA菌体花环均阴性；多核白细胞极少，胞内偶见红色之微尘状颗粒；单核吞噬细胞略大，胞浆内有弥漫分布的红色颗粒。此外，甲基绿复染显示的胞核形态，亦是细胞类型鉴别的重要依据。

　　2．2　非特异性干扰实验结果

　　2．2．1　菌株类别差异性：实验结果显示，ANAE阳性细胞仅同COWANⅠ株菌体形成花环，而不与WOOD 46菌株结合，从而表明：抗Thy1标记的COWANⅠ菌株具有高度的特异性。

　　2．2．2　抗体差异性：ANAE 阳性胸腺细胞仅结合抗Thy1SPA菌体，而不吸附抗αFP-SPA菌体。因而表明：抗Thy1SPA菌体花环试验有免疫特异性。

　　2．3 应用双标记法对615小鼠胸腺及脾细胞的检测　结果见表1。

表1　　双标记法中615小鼠胸腺与脾淋巴细胞标记结果之比较

　　Tab 1　Comparison of Thy1，ANAE and Thy1-ANAE mar-kers in／on the thymus and spleen　lymphocytes of 615 mice using ANAE-anti-Thy1 SPA rosette technique

（n＝10）

markers（％）	thymus cells	spleen cells
Ⅰ total Thy 1+	93．51±4．10	47．50±4．33
Ⅱ total ANAE+	95．46±2．40*	45．85±4．40*
Ⅲ Thy1+-ANAE+	91．27±5．52△	41．45±3．97△△

　　*P＞0.05， compared with group Ⅰ；△P＞0.05， compared with group Ⅰ；P＜0.05，compared with group Ⅱ；△△P＜0.05， compared with group Ⅰ or Ⅱ

　　2．4　应用ANAE染色及抗Thy1SPA菌体花环双标记法对615小鼠胸腺和脾脏淋巴细胞标记状况分析　结果见表2。

表2　　应用双标记法对615小鼠胸腺及脾淋巴细胞标记物检测结果

　　Tab 2　Results of determination of the markers in／on the thymus and spleen cells of 615 mice using ANAE-anti-Thy1SPA rosette technique

（n＝10）

markers（％）	thymus cells 　　（	spleen cells 　　（
Thy 1+-ANAE+	91．27±5．52	41．45±3．97
Thy 1+-ANAE－	2．39±2．52	6．05±1．41
Thy 1－-ANAE+	4．17±4．16	4．40±2．93
Thy 1－-ANAE－	2．17±0.79	48．10±4．37

　　3　讨　论3．1　T淋巴细胞Thy1 阳性与ANAE染色阳性一致性的证明　MUELLER等（1975）发现“抗Thy1血清可破坏ANAE阳性淋巴细胞，而不能破坏ANAE阴性细胞”。作者希望进一步直接证明小鼠ANAE阳性细胞其表面具有Thy1抗原。李绍康和章谷生^［6］制备兔抗鼠脑血清，并利用其特异性深入开展了小鼠体内Thy1阳性细胞分布状况的研究。谈良瑾等^［3］亦介绍了检测小鼠T淋巴细胞特异性较高的抗鼠脑血清标记的SPA菌体花环试验。作者将其与ANAE组化法结合（即：ANAE和抗Thy1SPA菌体花环双标记法），对小鼠胸腺和脾脏细胞进行观察。表1所见胸腺和脾细胞ANAE与抗Thy1SPA菌体花环阳性率间有很好的一致性结果，表明：①双标记法中，抗Thy1SPA菌环同ANAE阳性一样，能很好反映615小鼠胸腺或脾脏T细胞数（P＞0.05），与MUELLER的研究结果相符；②在胸腺和脾脏，Thy1⁺-ANAE⁺即双标记阳性率，均小于或等于总Thy1⁺或总ANAE⁺数；表2结果显示：胸腺细胞在双标记法中Thy1⁺-ANAE^－、Thy1^－-ANAE⁺以及Thy1^－-ANAE^－的细胞数量很少，而双标记阳性的T细胞占绝对优势；但在脾细胞中，双标记阴性细胞（B细胞）为48.10％±4.37％，高于Thy1⁺-ANAE^－、Thy1^－-ANAE⁺细胞，并高于Thy1⁺-ANAE⁺细胞。作者认为：小鼠胸腺和脾脏Thy1⁺-ANAE^－与Thy1^－-ANAE⁺阳性细胞的意义以及ANAE⁺伴不同CD亚型T淋巴细胞的分布情况颇值得利用此法予以深入研究。

　　3．2　建立双标记法的实验体会　通常，皮质早期不成熟T细胞Thy1抗原密度很高；髓质晚期成熟T细胞其密度降低。T细胞生成速率很高，胸腺内所有T细胞每5～7 d更新一次。多数（98％）未成熟胸腺细胞很快死亡，仅有少数（2％，包括成熟、未成熟）胸腺细胞存活并离开胸腺，进入外周淋巴器官。亦有些成熟T细胞永远留在胸腺。作者利用双标记法，也检测到胸腺和脾脏内的θ抗原阳性、ANAE阴性的淋巴细胞；同时，还观察到胸腺细胞表面菌体数常较ANAE阳性脾细胞表面菌体数多，从而提示成熟T细胞Thy1抗原密度有所变化。在进行双标记时，作者有如下体会：①为保证抗Thy1SPA菌体花环应有的最高阳性率，宜选用10％的标准菌体原液；②鉴于作者观察到脾细胞悬液中存在一定量的单核吞噬细胞，故建议应用ANAE-抗Thy1SPA菌体花环试验时，常规复染甲基绿，以利于细胞识别；③行ANAE染色时，应注意细胞悬液须及时固定，并严格掌握孵育液的pH及孵育时间等；④各家报告正常小鼠Thy1阳性细胞率有所差异，甚至同一作者亦然，认为与所用的抗血清种类、批号、浓度、检测方法及动物品系均有一定关系，故于正式实验时须作对照，以进行对比研究。

　　3．3　双标记法中标记物检测的原理　MUELLER发现，抗θ血清可破坏ANAE阳性淋巴细胞，ANAE阴性者则否。在ANAE法^［1，4］中，ANAE是一种在酸性环境发生作用的非特异性同功酶，能将底物α-乙酸萘酯水解生成α-萘酚，后者在羟基相邻的碳位上，与六偶氮副品红结合，产生棕色沉淀，沉积于细胞浆。SPA花环法^［8］的第一抗体为抗Thy 1血清；第二抗体代之以金黄色葡萄球菌CowanⅠ菌株，此菌株胞壁含有A蛋白（SPA），能与Ig的Fc段结合，引起细菌粘附（与免疫萤光法一样，敏感度颇高）。T细胞膜上的Thy1这种分化抗原，分子结构属于免疫球蛋白超家族（Ig superfamily）成员，由单基因编码。为111个氨基酸组成的肽链，籍尾部的磷酸肌醇酰基结合至C末端半胱氨酸残基上，使Thy1多肽分子锚定于T细胞膜双层类脂层之间。相应抗体——抗Thy1抗体对小鼠T细胞是一种强而有效的活化剂，其活化依赖于T细胞受体（T cell receptor，TCR）与CD3的复合物（即TCR-CD3复合物）的协同表达^［7～10］。其中，最常见的组成形式为TCR_αβ-CD_{3γδεεζζ}^［10］，相应的发生系通过由原癌基因（proto-oncogene）src所编码的酪氨酸蛋白激酶P59^fyn使TCR-CD3复合物于胞浆内酪氨酸磷酸化，促使细胞内信号传递的进行，造成相应细胞破坏。

　　［作者简介］　骆云鹏（1943－），男，四川华阳县人，副教授，博士后，主要从事肿瘤免疫方面的研究。

［参考文献］

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　　［2］ MALE D．免疫学简明图解［M］．见：骆云鹏，段 林，范维珂，等译． 成都：四川大学出版社，1991.10－30.

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　　［6］ 李绍康，章谷生． 鼠类淋巴细胞表面抗原的异种抗血清制备、鉴定和应用［J］． 上海免疫学杂志，1983，3（2）：114－118．

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　　［收稿日期］　2000-04-18；　［修回日期］　2000-06-18