“体外培育牛黄”研发访谈录

    体外培育牛黄指纹图谱技术研究
　　记者：请您就体外培育牛黄及其指纹图谱技术的背景及意义给我们介绍一下，好吗？ 
　　盛龙生研究员：很高兴向大家介绍体外培育牛黄指纹图谱研究的相关情况。当前，中药指纹图谱技术在国内外已成为一种发展趋势。中药指纹图谱技术是中药生产质量的一种新型标准，可以确保中药产品的一致性；也是组分群体的特征图谱，能全面反映中药所含化学成分的种类与数量，进而反映中药材及其产品的质量。指纹图谱获得的是中药不同个体的化学成分信息，用图形或图案方式表达，进行比对和分析，可实现对中药未知物质群整体的质量控制，是实现多种成分整体相关质量评价的关键技术，也是中药创新、研究开发、质量鉴别、鉴定的必要技术手段。
　　中药指纹图谱技术主要体现了信息获取、信息处理、信息挖掘三方面的内容。具体来讲，就是从中药物质基础的角度出发，运用现代分离分析科学的手段，获取中药化学指纹图谱。结合药效研究和相关物质成分的分离鉴定，经效谱关系研究，获取中药药效组分指纹图谱，并将已取得的指纹图谱用于中药材、中间体、中药复方制剂的质量控制以及创新药物研究的实践中，最终解决中药质量评价的科学性和关键问题。
　　动物药材的指纹图谱一向是指纹图谱研究的难点，现阶段以单一化学成分分析的观点，不适合牛黄这一复杂成分分析体系。而解决这一难题的有效手段，就是要借助已被国际社会所认可的中药指纹图谱技术。借助计算机和现代分析技术，可以将中药的特性和有效成分采用图谱的形式描绘出来，使每味中药都拥有如人的指纹一样的标准图谱，这就是中药指纹图谱。
　　记者：你们采用指纹图谱技术检测发现武汉大鹏药业生产的体外培育牛黄与天然牛黄具有基本一致性，您能否对此作一详细讲解？
　　盛龙生研究员：好的。我受武汉大鹏药业有限公司的委托，对体外培育牛黄进行了指纹图谱的研究。我们采用红外光谱、傅立叶变换红外分光光谱、高效液相色谱、薄层色谱进行过分析研究，在次基础上，我们开展了体外培育牛黄的指纹图谱研究。结果表明与天然牛黄具有相同的特征谱图，大家可以看一下这两张图（参见图一、体外培育牛黄薄层扫描图谱。图二、傅立叶红外光谱分析）
　　具体的结果如下：
　　①红外光谱分析结果：天然牛黄与体外培育牛黄在1730-1350cm-1区间，均有胆红素盐及胆红素高聚物质的特征峰。
　　②傅立叶变换红外分光光谱仪分析结果：体外培育牛黄与天然牛黄均见1690cm-1为羧酸类；1629-1565cm-1为酰胺类；1404cm-1为羟基类。
　　③高效液相色谱分析结果：胆酸、去氧胆酸对照品的图谱与体外培育牛黄、天然牛黄中的胆酸、去氧胆酸一致。
　　④薄层色谱分析结果：体外培育牛黄、天然牛黄色谱中，在与胆酸、去氧胆酸对照品相应的位置上显相同颜色的荧光斑点。
　　⑤微量元素含量测定结果：体外培育牛黄与天然牛黄的微量元素及其含量均基本一致。
　　⑥氨基酸含量测定结果：体外培育牛黄与天然牛黄含有相同的17种氨基酸。
　　记者：你们对体外培育牛黄及天然牛黄的稳定性对比研究情况如何？
　　盛龙生研究员：我们做了10批以上体外培育牛黄与多批天然牛黄多个提取部位（包括酸水、酸醇和二甲亚砜提取液）的成分，即氨基酸、肽类、胆汁酸类、胆红素类等，均基本一致。且10批体外培育牛黄三个提取部位的指纹图谱有较好的相似性，说明体外培育牛黄的工艺是稳定的。（参见图三、10批体外培育牛黄酸水提取液HPLC-MS  TIC叠加图谱。图四、4批天然牛黄与1批体外培育牛黄酸醇提取液中有紫外吸收成分的HPLC叠加图谱 ）
　　记者：请您再介绍一下对氨基酸、肽类(蛋白质)的检测研究结果？
　　盛龙生研究员：我们采取酸水提取液（氨基酸、肽类）TOFMS的方法分析表明：体外培育牛黄的酸水提取液中主要含有胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸，以及微量带有双电荷的分子量在1000-1800左右的寡肽，未见游离氨基酸。
　　同时，还采用了酸水提取液的HPLC-MS分析。结果表明，酸水提取液主要含有结合型胆汁酸等水溶性成分，未能找到肽类成分。而酸醇提取液的HPLC-MS分析结果则表明，酸醇提取液主要含有游离去氧胆酸等脂溶性成分。（参见图五、体外培育牛黄酸醇提取液的HPLC-MS  TIC图谱。图六、天然牛黄（ 0913-008）与体外培育牛黄酸醇提取液HPLC-MS  TIC叠加图谱。　　图七、批天然牛黄与1批体外培育牛黄二甲亚砜提取液HPLC叠加图谱。天然牛黄与体外培育牛黄比较，二甲亚砜提取液中成分种类基本一致，但相对含量稍有差异)。
　　记者：请您综述一下以上指纹图谱研究情况的结论。
　　盛龙生研究员：我们对4批天然牛黄和10批体外培育牛黄的指纹图谱及其中的胆汁酸类和胆红素类等成分进行了分析，由色谱保留行为和质谱数据证明天然牛黄和体外培育牛黄的成分一致，均含有牛磺胆酸和甘氨胆酸这两种结合胆酸。在天然牛黄和体外培育牛黄中，胆红素类成分也是一致的，共检出了5种胆红素。综合以上情况，得出指纹图谱研究结论：
　　①体外培育牛黄与天然牛黄三个提取部位（包括酸水、酸醇和二甲亚砜提取液）的成分，即胆汁酸类、胆红素类等，均基本一致。
　　②10批体外培育牛黄三个提取部位（包括酸水、酸醇和二甲亚砜提取液）的HPLC指纹图谱有较好的相似性，说明体外培育牛黄的工艺是稳定的。
　　③4批天然牛黄的之间成分也基本一致，但某些成分，尤其是胆汁酸类成分的比例有较明显差异。说明天然牛黄的质量不稳定。
　　④拟用胆汁酸的HPLC指纹图谱作为牛黄的特征鉴别方法之一，采用蒸发光散射检测器（ELSD）。
　　⑤已发现酸水和酸醇提取液中含有微量肽类成分，尚待进一步研究。
　　⑥拟应用等离子质谱技术对天然牛黄和体外培育牛黄的无机盐进行分析。
　　记者：谢谢您给我们作的介绍。