金 航，张金渝，张智慧:影响花药培养的主要因素

(云南省农业科学院药用植物研究所，云南昆明650223)
    自1964年印度学者Guha和Maheshwari从毛叶曼佗罗(Datura inoxia)花药培养中得到单倍体植株以来，花药培养便成为生物学科中研究的重要内容之一花药培养虽然具有不少优点，但作为植物生物育种的手段还有许多局限，其中有些植物花药培养的诱导率、绿苗分化率低，即花药培养力低是主要原因。要解决花药培养力低的问题，目前应从研究影响花药培养的各种因素人手来提高花药培养的效率。
l  材料
1．1  材料基因型
    材料的基因型是花药培养是否成功的关键因素。不同基因型的材料，花药诱导率不同。花药培养力的大小是受多基因控制的数量性状．1，因而随基因型的差异变化很大。基因型对花培的影响主要有以下几个方面，产生单倍体的途径(胚状体或愈伤组织)、发生的频率、形成的时间、植株的再生能力以及在所形成的植株中单倍体与二倍体的频率等。王子霞等发现十个玉米材料的花药愈伤组织诱导率和分化率不同，有6个材料诱导出愈伤，诱导率最高的为O．317％，最低为0．0167％，这6个材料中只有2个分化出苗而其余4个材料愈伤诱导率为0。在栽培稻中，一般以糯稻的培养力最高，其培养力高低顺序为糯>粳>粳／籼>籼型杂交稻>籼。王立浩等报道在辣椒的花培中有些材料对某些培养基根本无反应。烟草属各个种花药培养获得花粉植株的比例最高，但郎氏烟草花药培养却很难成功。由此可见，基因型的影响在花药培养中普遍存在。
1．2  小孢子发育时期(即花粉发育时期)  处于不同发育阶段的小孢子，其花药培养效率差别很大。只有花粉发育到一定时期的花药，才对外界刺激最敏感，而不同植物的花粉对外界刺激的敏感时期是不同的。对多数植物来说，单核中期至单核晚期的花粉都易形成花粉愈伤组织或花粉胚。如水稻、烟草的花粉，从单核中期到双核期皆可接受诱导，形成胚状体或愈伤组织；玉米的花粉以单核中后期为佳；番茄花培的最适时期为单核期；辣椒花培胚状体形成的频率在单核后期为最高(9．7％)，双核次之(8．06％)，单核中期最低(3．8％)．
2  预处理
    在大多数花药培养成功的例子中，要想获得理想的培养效果，常常在花药接种前进行各种预处理。预处理的方法主要有低温、高温以及甘露醇预处理等，其中以低温预处理应用最为广泛。
2．l  温度预处理  黄英金等”发现，对水稻亚种间杂种的花培，多数基因组合给以6℃一8℃4 d的预处理与不进行预处理相比，对提高出愈率及绿苗分化率均有极显著的促进作用。低温预处理还可以提高番茄愈伤组织的诱导率，而茄子的花药只有经过热处理才能产生胚状体。庄军平等以辣椒为材料，研究了不同温度处理对辣椒花药愈伤组织形成的影响，接种前花蕾经l一7 d 0℃一4℃低温预处理有利于花药愈伤组织的形成，其中以3—5 d处理的效果最好；接种后经12—16 h 32℃短期热激处理，也有利于花药愈伤组织的形成，但超过60 h反而抑制愈伤组织的形成。试验还对低温预处理和短期热处理的效果进行了比较，发现单独热激处理的效果稍优于单独低温预处理，而两者配合处理的效果与单独热激处理的效果差异不明显。此外，曹晓燕等对毛刺槐花培的研究结果显示在4℃条件下不同时间的低温预处理对愈伤组织诱导率没有明显的促进作用。
    关于高温预处理对提高花粉胚或愈伤组织诱导率的作用机理目前研究尚少，有学者发现是由于高温预处理导致内源激素和蛋白质产物的不同所致。  关于低温预处理提高花粉胚胎发生能力的作用机理存在以下观点。Nitsch等认为低温能改变花粉粒第一次有丝分裂纺锤体的轴向，并且还能破坏纺锤体的微管蛋白，从而阻止纺锤体的形成，使有丝分裂的正常过程被打乱，不能进行极性分化，导致去分化过程的发生。Sunderlandc~a?认为，低温作用的机理不在于改变纺锤体的轴向，而在于使花粉保持活力，使其不在数天内死亡，在此期间营养细胞得以完成细胞质的改组转向胚胎发生。徐武等报道了低温预处理过程中大麦花药内源激素的变化，推测  低温预处理改变了花药内源激素的含量，阻断了花粉原来的发育方向，使其由配子体的发育途径转向孢子体的发育途径。黄斌提出低温预处理的可能作用机理为：(1)低温预处理引起花药内源激素发生变化，进而影响愈伤组织的形成；(2)引起小孢子的孤立化，花药壁细胞和绒毡层在低温预处理过程中逐渐退化解体；(3)使绝大多数小孢子保持其生活力。
  2．2  甘露醇预处理  花药在离体条件下经过一定浓度的甘露醇预处理可以提高花药的培养率。李文  泽等发现：甘露醇预处理比低温预处理和对照 能明显地提高大麦花粉存活频率；甘露醇预处理3 d 能明显提高大麦花药培养愈伤组织诱导率、绿苗分化率及绿苗产量。甘露醇不能作为碳源或能源被代谢利用，这一点大多数学者已达成一致，但对甘露醇  预处理的作用机理目前主要存在两种观点：一种认为甘露醇的作用是给予小孢子一个适当的渗透压，这对维持小孢子的活性是必需的；另一种观点认为甘露醇预处理的主要作用是导致小孢子短时间的营养饥饿，从而使小孢子改变其发育方向，引起小孢子的去分化过程。
3  培养基
3．l  培养基类型  花药培养应用的培养基类型主要是MS、N6、White、Miller(即Blaydes)、B5、Nitsch等，其中应用较广泛的是MS基本培养基。不同的植物种类对基本培养基的要求不同。如在烟草花培中，Nitsch、H培养基效果较佳，而水稻花培常用Miller培养基。N6培养基在水稻、玉米等作物上也有良好的效果。在小麦上，通常应用的是MS基本培养基。一些十字花科的植物(如甘蓝、油菜)则常使用MS和B5培养基。人参的花药培养在MS、B5、、N6、Miller、改良White和改良Nitsch6种培养基中，除改良Nitsch外，其余5种都有较高的花粉愈伤组织诱导率。
3．2  碳源  一般情况下，糖浓度在花药培养中要比一般组织培养高，有人认为这是由于花粉细胞的渗透压比花丝等体细胞渗透压高的缘故，高浓度糖不利于体细胞的生长，但不妨碍花粉的生长。在玉米花药培养过程中，培养基中附加12％一15％的蔗糖，其诱导愈伤组织的效果明显优于附加9％的蔗糖培养基，蔗糖浓度过低不利于诱导培养。毛刺槐的花培中，蔗糖浓度从3％增至9％时，愈伤组织诱导率也随之增加，当蔗糖浓度增至12%时则愈伤组织诱导率显著降低。
    在小麦、大麦、小黑麦、黑麦、燕麦和玉米等作物中，在诱导花粉形成胚状体或愈伤组织阶段，应用麦芽糖代替蔗糖作为培养基的碳源有较好的效果。Ramon比较了辣椒花培中蔗糖、果糖、麦芽糖的培养效果，得出结论，麦芽糖做碳源，胚的发生率最高。麦芽糖作碳源优于蔗糖的可能原因：(1)作为营养物，麦芽糖可分解为葡萄糖和葡萄糖一1一磷酸；蔗糖分解为葡萄糖和果糖，果糖可能对培养物有害。(2)作为渗压剂麦芽糖分解速度显著慢于蔗糖，可使培养物保持相对稳定的渗透压环境。
3．3  激素  在培养基的各种成分中，激素的水平和配比非常重要，常对诱发细胞的分裂，生长和分化起决定作用。在花培中常用的激素有二类：一类为生长素，如2，4一D(2，4一二氯苯氧乙酸)、IAA(吲哚乙酸)、NAA(萘乙酸)等．另一类称为细胞分裂素，如KT(激动素)、6一BA(6一苄基氨基嘌呤)和玉米素，一般生长素类物质对诱导细胞脱分化形成愈伤组织及生长有决定性作用，分裂素对愈伤组织的分化和胚状体形成有主要作用。在花培中，广泛使用的2，4一D对于许多植物的花粉启动、分裂、形成愈伤组织和胚状体起着决定性的作用。如曹晓燕等发现，毛刺槐的花培中单独附加BA无法诱导愈伤组织的形成，单独附加2，4一D可诱导愈伤组织的形成，且BA与2，4一D配合使用比BA与NAA配合使用对愈伤组织的诱导效果好，2，4一D在毛刺槐花药愈伤组织的形成过程中起着非常重要的作用。但是，由于2，4一D是一种其他植物激素的拮抗物质，其本身具有刺激组织形成层活性的作用；虽然随着浓度增大，诱导愈伤组织的频率也增加，由此产生的愈伤组织其分化能力都显著降低，因此不能为了追求较高的愈伤组织诱导率而在初代培养基中加入过多的2，4一D。如褚云霞等在百合的花培研究中发现2，4一D浓度的升高将降低愈伤组织的分化能力；王玉英等研究也表明在辣椒花培中高浓度的2，4一D、NAA促进了愈伤组织的形成而降低了胚状体的形成。因此，在花培中应该通过调整生长素和分裂素的比例来控制花粉细胞的脱分化和再分化以求得大量的愈伤组织并从愈伤组织中分化出大量花粉植株或获得胚状体。
3．4  活性炭(AC)  活性炭应用于花培是Naka—mura等首先提出的，目前已经在油菜、马铃薯、烟草、玉米、黑麦、小黑麦、龙眼、辣椒和甜椒等花培中得到应用。AC具有较强的吸附特性，在植物的组织培养中常用来吸附培养基中的有害物质，特别是蔗糖在高温灭菌过程中降解产生的5一羟甲糠醛，花药组织产生的乙烯、酚、醌类物质以及琼脂中的杂质。如在玉米花培中加入O．5％的AC可以使愈伤组织或胚状体的诱导频率提高一倍左右，在分化培养基中加入O．5％的AC还能促进分化的幼苗健壮，根系发达。但是，AC的吸附作用没有专一性，它既可吸附培养基内的有害物质，同时也能吸附培养基中的生长调节物质、Fe-EDTA、VB5、叶酸和烟酸等有益物质，如张玉华等在过滤灭菌的液体培养基体系中研究了甘露醇预培养和诱导过程中，AC对大麦花培效率的影响，结果显示，AC会降低花粉胚和愈伤组织产量和质量，影响植株分化率，尤以诱导培养基中添加AC的影响较大。在该试验中，以液体培养基代替固体培养基，用过滤灭菌法代替常规高温高压灭菌法，从而排除了培养基中的蔗糖等在高压灭菌条件下产生有害物质的可能性。由此可见，AC的使用一定要慎重。
4  培养条件
4．l  温度  温度是花药培养的一个重要培养条件，影响花药培养的效率。早期的一些报道显示花药培养的温度一般不超过28℃。现在发现不少植物(如：水稻、小麦、曼佗罗等)在较高的温度下培养效果更好。目前，对小麦花药的培养温度研究较多，普遍认为：不同基因型对培养温度反应差异很大，并且此种反应是可遗传的；对大多数材料，培养的适宜温度是28℃士0．5℃；出愈率和绿苗率对温度的反映正好相反，在25℃一30℃范围内、温度度愈高，出愈率愈高；反之亦然。在水稻中也同样也发现高温可以提高愈伤组织的诱导率，但愈伤组织的分化能力有下降趋势。
4．2  光照  有关光照对离体花药培养的影响的研究报道很少。一般认为愈伤组织诱导期间进行暗培养或散射光培养较好。对某些烟草品种，连续的光照可以提高单倍体植株形成的频率；强光有利于小麦的绿苗分化，但会抑制愈伤组织的形成。
5  讨论
    花药培养作为诱导植物单倍体植株的一种主要手段，一直受到遗传育种界的关注。随着广泛的研究及技术改进，小麦、大麦、烟草、水稻等植物的花培效率已经达到了应用的水平，但受基因型的影响，很多植物材料的诱导率仍然很低。因此，寻求花培的最佳外界条件，进一步提高花培效率，是目前花培的主要研究内容之一。在具体的花培过程中，要提高培养效果，应从影响花培的几个因素，结合实验室条件和材料本身的特点来考虑，制定相应的培养方案。