赵 宇 谢培山 卢平华 王祥红:枳实、枳壳、青皮和陈皮等药材中辛弗林含量测定研究，

珠海科曼中药研究有限公司  珠海  519085)
杨  辉  (中南大学化学化工学院  长沙  410083、
    美国食品药品管理局(FDA)在20世纪90年代颁发限制麻黄碱使用的相关规定，2004年6月，又发布禁止销售含有麻黄碱的食品增补剂(dietray  com—plement)的禁令，辛弗林(synephfine)因其化学结构近似麻黄碱(图1)，也受到波及。近来，美国、欧洲、澳洲等国家和地区开始对含辛弗林草药的使用提出警告，引起人们的注意。
    辛弗林主要存在于芸香科柑橘属(Citrus)植物，常用中药陈皮、青皮、枳实和枳壳均为该属植物果皮或果实。尤其枳实，文献报道辛弗林含量较高．除中医的传统应用外，也有生产注射剂在临床应用，用于抢救各种休克、心衰以及治疗胃及十二指肠溃疡等病症。枳实提取物是西方国家用于减肥的食品添加剂产品的原料。不论从其生理活性．还是不良反应，辛弗林的的存在使上述柑橘类果实药材倍受关注。中国药典2005版一部以辛弗林作为考察枳实药材的指标性成分，也有文献对枳实和枳壳中辛弗林含量测定的报道，但很少涉及青皮和陈皮药材中辛弗林的含量测定。
    本文建立了辛弗林在枳实、枳壳、青皮和陈皮药材中的含量测定方法，考察了该成分在枳实、枳壳、陈皮、青皮、化橘红、香橼、佛手和橘核中的含量分布情况，并对辛弗林在橘果实生长期内含量变化进行了跟踪检测。旨在为这些药物的安全使用以及相关的药理研究提供依据。
    一、材料与方法
    1．样品收集
    本实验收集到枳实、枳壳、青皮、陈皮以及化橘红、香橼、佛手和橘核药材共95份，其中枳实药材20份(6个为江西道地药材)；枳壳药材22份(9个为道地药材)；陈皮药材37份；青皮药材10份；化橘红3份(2个为化州道地药材)；香橼药材2份；佛手药材和橘核药材各1份。
    2．试剂和仪器
 Agilent 1100系列高效液相色谱仪(包括1315A全自动进样仪；G1315B DAD二极管阵列检测器；恒温柱温箱)；万分之一电子天平；超纯水发生器甲醇、乙腈试剂均为光谱纯，水为去离子蒸馏水；磷酸为分析纯；辛弗林对照品购自中国药品生物制品检定所。
    3．对照品制备
    精密称定辛弗林对照品。加入磷酸水溶液(0.1tool.L-1)溶解，制成每毫升含辛弗林约0．1mg的溶液即得。
    4。供试品制备
    取样品粉末约0．3g(过2号筛，干燥3h)，精密称定，加入0．1mol．L-I磷酸水溶液40mL。100℃水浴加热回流提取2h。放冷。滤人50mL容量瓶中，残渣及容器用提取溶剂适量洗涤，定容至刻度。精密量取本溶液5mL，通过预处理的C18小柱，收集洗脱液，继续用5mL O．1mol．L-1的磷酸溶液洗脱，收集洗脱液并定容至10mL即得。样品临用前过0．45μm微孔滤膜即可进样分析。
    5．色谱分析条件
    色谱柱：Hypersil BDS C18柱(250mmx4．6mm，5p,m，大连依利特生产)，流动相为乙腈一水一十二烷基磺酸钠(31：69：0．2)(用磷酸调节PH值至2．0)；流速lmL．min-1；柱温35℃；检测波长225nm；运行时间25min。
    6．测定这
    分别取供试品溶液和对照品溶液各20μL注入  HPLC分析．记录流出曲线即得。
    在实验过程中，曾与文献2、3提供的方法进行了对比，结果表明这些方法辛弗林提取率相对偏低。色谱条件是在对比文献的基础之上．参考了2005版药典未出版前网上发布的枳实提取物的含量测定色谱条件(后未列入2005版药典)，略作修改而成。经实验方法学验证和系统适应性考察后，认为本实验采用方法较为合理，并能同时适用于陈皮、青皮、枳实和枳壳4味药材中辛弗林含量测定之用。
    二、实验结果
    1．药材中圭弗林含量测定方法学验证
    (1)重现性。
    取同一批号药材，按供试品方法制备供试品溶液6份，记录色谱流出信号。以辛弗林含量为考察对象，计算6份样品所得辛弗林含量，RSD小于1．0％。
    (2)精密度。
    取同一份供试品溶液，连续进样6次，记录色谱流出信号。以辛弗林含量为考察对象。计算6次分析所得辛弗林含量。RSD小于0．5％。
    (3)回收率。
    采用同一批药材，取药材粉末约0.15g，精密称定。精密加入相当于药材中辛弗林含量的对照品溶液(约相当于辛弗林浓度为0．1078mg．mL-1的对照品溶液5mL)，再加入0．1m01．L-磷酸水溶液35mL，按供试品制备方法制备样品共6份，所得回收率为99．1％、99．8％、100．8％、99．0％、100．9％和102．7％，RSD等于1．4％。
    (4)线性。
    精密取对照品溶液lmL、2．5mL和5mL和10mL，分别置于25mL容量瓶中，用0．1m01．L-磷酸水溶液稀释至刻度得到1、2、3和4号标准溶液。另取1号标准溶液5mL，置于20mL容量瓶中，加0．1m01．L-1磷酸水溶液稀释至刻度，得5号标准溶液。取上述各标准溶液和未稀释对照品溶液各20μL进样分析，以样品峰面积对样品质量作图，得到校正曲线：y：2503．4x-22．7，相关系数r=0．9999。
    2．药材中辛弗林含量测定结果
    陈皮药材中辛弗林含量分布在0．10％~0．75％之间．其中辛弗林含量在O．1—0．4％之间的陈皮样品占总体样本的80％以上。以辛弗林含量绘制陈皮样本正态概率图，所有样本基本分布在图示直线附近，表明样品辛弗林含量分布具有正态性，从而说明样品取样具有代表性，辛弗林含量在陈皮中分布具有规律性(图2)。(以下青皮、枳实和枳壳样本经过正态概率统计分析，每类样本中辛弗林含量均具有规律性，不再一一列举)。以25％和75％百分位数计算，陈皮样品辛弗林含量主要分布区间为0．2-0．4％。统计样本测定结果(按中位数计算，下同)，陈皮药材中辛弗林含量平均为0．32％。
    青皮样品含有辛弗林的量比较高，大部分样品含量在O．4％以上，最高含量超过1％。以样本中位数计算，辛弗林含量为0．58％。
    枳壳药材中辛弗林含量均小于O．2％，甚至有1份药材基本检测不到辛弗林(经过鉴定分析后发现该样品是柚幼果的混淆品)，统计结果为0．13％。
    枳实药材中辛弗林含量比枳壳中高．大部分药材含量在0．3-0．6％之间。统计结果表明枳实含辛弗林0．45％。
    香橼、橘核、化橘红以及佛手在收集到的样品中均未检出辛弗林。
    3．药材采收期对圭弗林含量的影响
    以陈皮样品为例，考察了辛弗林在橘果皮生长期内的含量变化，辛弗林含量随药材的生长程度变化呈规律性变化，即果实越趋于成熟，辛弗林含量越低，一般在未成熟果皮中的含量较高(图3)。
    辛弗林在未成熟果皮中含量较高而成熟果皮中减少的现象应该与其在植物体内的代谢转化过程相关。据报道．枳实等药材中还含有与辛弗林结构类似的N一甲基胳胺等生物碱成分。这些成分之间是否存生源途径上的竞争或转换值得进一步研究。不同产地的陈皮在不同采收期内辛弗林含量变化曲线有差异。以新产陈皮辛弗林含量最小，为O．2％左右，长沙产陈皮辛弗林含量较高。这种差异可能主要是由地域和环境等外在因素的不同所致。
    三、讨  论
    近年来．由于含辛弗林成分的柑橘属果实提取物在西方的滥用，其毒副作用开始被越来越多的医药界人士关注。意大利曾有学者通过动物实验测试了酸橙提取物(约含6％的辛弗林)，指出该提取物在较低剂量时就呈现出异常毒性，因而认为该物质对人的身体健康存在潜在威nbl61。而且，当辛弗林与其它中枢神经兴奋药如咖啡因等合用时，它们对心血管的作用加剧。因此研究柑橘属果实类常用中药陈皮、青皮、枳实、枳壳的辛弗林含量，无论从合理使用还是从避免其毒副作用方面均有实际意义。这些关于辛弗林毒副作用的报道，似乎与我们长期以来中医一直使用枳实、枳壳来治疗疾病的原则背道而驰。实际上这恰好反映了中药现代化过程中传统中医药与西方医药学之间的冲突。中医强调整体、多用复方以求诸药多种成分之间的协调、互补或制约而得增效而减毒的效果。而西方医药则强调单一成分的疗效，而忽略天然药物多种成分之间的制衡。此外，西方过去以为天然药物安全而滥用，等到毒副作用出现，又惊呼这些草药“不安全”而加以封杀，对此，西方一些科研人员也有不同的声音。其实导致麻黄、枳实之类的药物出现毒副作用的始作俑者恰好是不熟悉、不接受中医传统经验，视之为”不科学”的西方医药对中药的滥用造成的。当然从另一方面看．由于现代医药学的深入研究，也阐明了过去长期以来中医药没有发现的问题，如辛弗林的毒副作用的发现就需要我们更多的研究与关注。
    分析辛弗林在不同产地、采收期中药材含量变化规律后，可以比较辛弗林用药剂量与药材用药剂量之间的定量关系。譬如枳实、枳壳、青皮和陈皮在中医的用药剂量一般是每日3—10g，以辛弗林100％提取率计算，实际相当于辛弗林的每日摄人量约为13—45mg(枳实)、4-13mg(枳壳)、18—60mg(青皮)和9—30mg(陈皮)。当然这种比较只是一种简单的换算关系，实际情况下，还要受到药物剂型、给药途径等因素的影响，更为重要的是辛弗林与柑橘属植物果皮中的二氢黄酮类成分复杂的相互作用机制尚须综合考察。在掌握辛弗林相关的药理作用后，应当综合这些因素，将含辛弗林的中药材及其提取物、制剂控制在合理用药范围，以确保用药安全、有效。
致谢：感谢中南大学化学化工学院中药现代化研究中心易伦朝博士提供部分药材样品。